鲎素Tachyplesin Ⅰ在大肠杆菌中的重组表达及其抑菌活性

为了高效制备抗菌肽,本文将鲎素抗菌肽目的基因Tachyplesin-1(TP1)在大肠杆菌BL21中进行表达。首先构建表达质粒pET32a-TP1并转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行目的融合蛋白表达,并利用His标签与镍柱亲和层析对融合蛋白进行纯化。纯化后的融合蛋白经羟胺裂解液切割和质谱分析后,获得单一的TP1重组蛋白,最后对其抑菌活性进行表征。结果表明,重组菌在37℃经IPTG诱导后,融合蛋白表达成功,TrxA-TP1融合蛋白的分子量在20 kDa左右。经羟胺裂解得到的重组蛋白TP1对于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)均具有良好抑菌活性,最小抑菌浓度分别为6和10 mg/L。本研究为鲎素抗菌肽TP1的开发应用和大量生产奠定了基础。     

应用不同载体探索环二肽合成酶AlbC的高效可溶性表达

AlbC是一种环二肽合成酶，可用于合成具有抗菌性和抗肿瘤性的环二肽及后续衍生物。近年来，AlbC的产物在白酒及其副产物黄水中被相继检出，对赋予白酒健康功能起着至关重要的作用。为实现albC基因的高效可溶性表达，本研究以实验室保藏的枯草芽孢杆菌Y1为模板克隆出albC基因，构建了pQE30-albC,pET28a-albC,pET28a-SUMO-albC,pGEX-6P-1-albC 4个重组质粒，并探究了不同诱导温度下每个重组质粒的诱导表达情况。结果表明：（1）pQE30-albC不表达或者表达量低；pET28a-albC正确表达，但表达量和可溶性表达量都较低，纯化后融合蛋白浓度为1.0 mg/L;pET28aSUMO-albC正确表达，且实现可溶性表达，纯化后融合蛋白浓度为30 mg/L，切除SUMO标签蛋白后浓度为22 mg/L;pGEX-6P-1-albC正确表达，且实现可溶性表达，纯化后融合蛋白浓度为44 mg/L，切除GST标签蛋白后浓度为34 mg/L;(2)拥有GST促溶标签的pGEX-6P-1载体是4组载体中达到albC基因可溶性表达水平最高的载体；（3）在4种载体中...     

双肽细菌素Plantaricin EF在乳酸乳球菌中的异源表达及其抑菌活性

乳酸菌细菌素是乳酸菌在代谢过程中由核糖体合成的具有抗菌作用的多肽或蛋白质,具有抗菌活性强,安全,容易降解,无毒副作用和无耐药性等优点,在食品、医药和农业等领域具有巨大应用潜力。Plantaricin EF(PlnEF)为class IIb类细菌素,抑菌效果好,而在天然乳酸菌中表达水平较低,且难以纯化。本研究拟运用乳酸菌表达系统,进行PlnEF的异源高效表达。通过PCR扩增得到Plantaricin E(PlnE)和Plantaricin F(PlnF)的基因序列,构建重组质粒p NZ8124-pln E和p NZ8124-pln F,并转化乳酸乳球菌NZ9000获得异源表达菌株。运用NICE系统诱导双肽细菌素PlnE和PlnF的表达。建立高效纯化体系,得到的重组蛋白PlnE和PlnF质量浓度分别为2.629 mg/m L和2.397 mg/m L。利用牛津杯双层琼脂拮抗法研究PlnE、PlnF和PlnEF(等物质的量混合)的抑菌活性,结果表明,它们不仅能抑制革兰氏阳性菌,还能抑制革兰氏阴性菌,且PlnEF具有协同作用。     

黄粉虫抗菌肽的分离纯化及生物活性研究

本研究以黄粉虫为试材,采用碱性蛋白酶酶解黄粉虫蛋白制备获得了抗菌肽,并对其进行分离纯化,比较了不同组分及纯化后抗菌肽的抑菌活性、热稳定性及分子量。结果表明:大孔吸附树脂对蛋白酶酶解液动态吸附并梯度洗脱后得到5个组分,抑菌试验表明无水乙醇洗脱组分的抑菌活性最强。采用制备型HPLC对无水乙醇洗脱组分进一步纯化,得到两个组分(H-1,H-2),其中组分H-2对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均表现出较强的抑菌活性,且其最小抑菌浓度(MIC)为0.512 mg/m L。热稳定性试验表明,H-2具有较好的热稳定性,121℃加热20 min仍能保持较高活性。液质联用(LC-MS)结果表明,H-2的分子量为756.82u。本研究为黄粉虫抗菌肽的高效分离和纯化提供了科学依据,为黄粉虫抗菌肽在食品防腐中的应用提供了基础数据。     

PlnF抗菌肽在乳酸乳球菌中的分泌表达及抑菌活性鉴定

采用乳酸乳球菌表达载体对PlnF抗菌肽基因进行克隆表达,旨在使重组乳酸菌可以直接应用于食品的发酵和防腐之中。在乳酸乳球菌pNZ8149/NZ3900表达载体中,构建含有胞外表达信号肽的PlnF抗菌肽重组质粒,进一步在电阻200?Ω、电容25?μF条件下电转入NZ3900感受态内。经溴甲酚紫培养基筛选、菌落聚合酶链式反应验证、测序等鉴定正确的重组菌株,以1?ng/mL?Nisin诱导6?h后离心获得的上清液对金黄色葡萄球菌具有（14.03±0.23）mm的抑菌圈,经Tricine-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到在5.8～7.8?kDa间出现一条与预期大小相近的条带,进一步通过纳升液相色谱-电喷雾-串联质谱验证表明PlnF蛋白在pNZ8149/NZ3900乳酸乳球菌表达载体中正确地进行了胞外表达。     

杂合抗菌肽MgJ基因在毕赤酵母中表达条件的优化

为确定杂合抗菌肽MgJ基因的最佳诱导表达条件,将构建好的重组表达载体pPICZαA-MgJ经SacⅠ线性化处理,电转入巴斯德毕赤酵母GS115,利用抗生素Zeocin筛选阳性克隆,聚合酶链式反应（polymerase chainreaction,PCR）扩增验证,甲醇诱导表达。优化杂合抗菌肽MgJ诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度、初始菌体浓度表达条件。结果表明杂合抗菌肽MgJ的最佳表达条件为：28 ℃、250 r/min诱导培养,每24 h添加体积分数0.5%的甲醇,诱导时间120 h,MgJ表达量可达11.9 mg/L。纯化后获得的表达产物MgJ对S. aureus ATCC 29213有较好的抑菌活性,最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）为10 μg/mL。     

大头金蝇幼虫抗菌肽提取纯化及抑菌活性研究

目的:从大头金蝇幼虫中分离纯化天然抗菌肽,并检测抗菌肽的抑菌活性。方法:提取大头金蝇幼虫抗菌肽,粗提物经凝胶过滤色谱、阳离子交换树脂、反相色谱纯化,纯化产物检测其抑菌活性并利用GFC-HPLC测定其分子量。结果:最终纯化出一个活性组分,该组分对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度为20.40μg/m L,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为2.04 mg/m L,对大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.17 mg/m L;该活性组分分子量大小为2570 u。结论:该抗菌肽组分对铜绿假单胞菌有较强抑菌活性,有较好的开发利用价值。     

植物乳杆菌细菌素基因plnEF的克隆与异源表达

目的:构建目的基因plnEF原核表达系统,诱导工程菌BL21-p ET28a-PL-plnEF表达目的融合蛋白并纯化,以期获得大量纯度较高的植物乳杆菌PlnEF细菌素,开发新的食品防腐剂。方法:构建含plnEF基因的重组质粒,将其转入大肠杆菌BL21中,经过IPTG诱导大量表达目标蛋白,融合蛋白PlnEF经纯化后进行分子量大小、抑菌活性等的检测。结果:重组质粒pET28a-PL-plnEF在大肠杆菌BL21中成功表达,合成PlnEF蛋白,其分子量为15.6 k Da,且该融合蛋白对大肠杆菌JM109具有良好的抑菌活性。结论:plnEF基因片段能够在原核细胞中正确表达且具有活性,本文为进一步研究开发该细菌素作为生物防腐剂奠定了基础。     

花椒籽蛋白抗菌肽的抑菌作用及其稳定性研究

本研究采用菌落计数法对花椒籽蛋白抗菌肽的抑菌效果及稳定性进行了研究。结果表明:抗菌肽对大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抑制作用;抗菌肽的抑菌活性随浓度的升高而增强;经不同温度、加热时间处理后,抗菌肽的抑菌活性与对照相比无显著差异(p0.05);抗菌肽在经p H 2.0~12.0处理后仍有抑菌活性,p H 2.0时的抑菌率最低(58.13%),p H 12.0时的抑菌率最高(79.17%);随着金属离子浓度的增加,经K+、Ca2+和Fe3+处理后的抗菌肽的抑菌活性分别呈降低、增加、变化平缓的趋势,经0.1 mol/L K+处理后的抗菌肽的抑菌活性明显增强;经有机溶剂处理后,抗菌肽的抑菌活性有所降低;经吐温20、吐温80处理后,抗菌肽的抑菌活性极显著增强(p0.01),SDS对抑菌活性的增加不显著。因此,抗菌肽具有很好的热、酸碱、金属离子和有机溶剂稳定性,而表面活性剂(吐温20、吐温80)能使抗菌肽的抑菌活性显著增强。     

对虾抗菌肽PEN-3和PEN-4嵌合基因在大肠杆菌中的表达及抗菌活性测定

目的 表达融合2种具有对虾抗菌肽活性的新型抗菌肽.方法 利用overlap-PCR连接并扩增对虾抗菌肽Penaeidin-3和Penaeidin-4的嵌合基因序列,定向插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建此嵌合基因的表达质粒.将表达质粒转化至E.coli BL21(DE3),经终浓度1.0 mmol/L IPTG分别在37℃和15℃诱导表达4 h和14 h,SDS-PAGE分析嵌合蛋白质的表达,用抑菌圈法测定产物的抑菌活性.结果 获得了含有Penaeidin-3和Penaeidin-4嵌合基因的表达质粒;18%SDS-PAGE电泳显示,大肠杆菌中表达的嵌合蛋白质相对分子质量约14.7×103,主要以包涵体形式存在,包涵体15℃的表达量高于37℃的表达量;包涵体复性后,对枯草杆菌和溶藻弧菌具有明显的抑菌活性.结论 实现了2种对虾抗菌肽嵌合基因在大肠杆菌中的表达.     

重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽在大肠杆菌中的表达纯化及功能鉴定

本研究构建了编码重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽基因的原核表达载体pET28a-rhCⅠ,并将其转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行诱导表达。采用PCR的方法扩增重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽的cDNA序列,并将其克隆到原核表达载体pET28a上;重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达,并优化表达条件。利用SDS-PAGE和WesternBlot检测表达产物。大量表达重组蛋白,采用镍亲和层析进行纯化,并对纯化后的蛋白进行体外抗氧化研究以及促细胞增殖分析。结果表明,通过大肠杆菌Rosetta(DE3)诱导表达获得了分子量约为40ku的重组蛋白,与预期相符。经镍亲和层析获得纯度较高的蛋白,通过DPPH实验证明其有一定的抗氧化活性;而且MTT实验证实该蛋白可以促进小鼠成纤维细胞3T3细胞的增殖,为其在食品、化妆品和医疗行业的应用提供一定的理论依据。     

古细菌Pyrococcus furiosus嗜热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达

用PCR方法从嗜热古细菌Pyrococcusfuriosus的基因组DNA中扩增出胞外α 淀粉酶完整结构基因 ,插入表达载体pET2 8a中构建成质粒 pET amy(sig+) ,以质粒pET amy(sig +)为底物扩增出不含信号序列的α 淀粉酶成熟肽基因片断 ,获得质粒 pET amy(sig ) ,将重组质粒分别转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)。在T7启动子和lac操纵子控制下 ,通过IPTG的诱导在重组大肠杆菌细胞内分别表达出含信号肽和不含信号肽的融合蛋白。其中不含信号肽的融合蛋白具有与P .furio sus产生的胞外α 淀粉酶相似的酶学性质 :最适pH为 5 .0 ,最适温度约为 95℃ ,在 1 2 1℃下热处理 1h酶活仍能保持 50 %以上 ;含信号肽序列的基因的表达产物不能测到酶活     

草莓轻型黄边病毒外壳蛋白抗原表位预测、克隆、表达及其免疫原性分析

应用IEDB、DNAStar、DNAMAN和Snap Gene等生物信息学工具对草莓轻型黄边病毒外壳蛋白的氨基酸残基序列进行分析。选择一段抗原性较强的肽段(位于外壳蛋白27~38氨基酸残基处),依据大肠杆菌(Escherichia coli)的密码子偏好性化学合成了该肽段的DNA编码序列(AE)。AE片段克隆至E.coli表达载体pET32a(+)的Eco RⅠ和XhoⅠ位点,获得重组质粒pET32a(+)-AE。含AE片段的开放阅读框长561 bp,编码了一个187氨基酸残基的重组融合蛋白,理论分子质量为20.29kD。重组质粒pET32a(+)-AE分别在E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta中进行了诱导表达和条件优化。重组融合蛋白在E.coli Rosetta中的最佳表达条件为1.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)、35℃诱导表达2 h,产率为13.22 mg/L;在E.coli BL21(DE3)中的最佳表达条件是为0.5 mmol/L IPTG、30℃诱导表达2 h,产率为9.55 mg/L。重组融合蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、质谱鉴定表明,其含有所预测的草莓轻型黄边病毒外壳蛋白抗原表位肽段AE。AE重组融合蛋白经Ni~(2+)亲和色谱纯化、EK酶切、分子筛除去融合蛋白标签后,免疫产蛋鸡。从免疫鸡所产鸡蛋中提取鸡卵黄免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk,Ig Y),Dot-Blot检测抗体结合活性。结果表明,所提取的IgY可特异性识别AE肽段和SMYEV外壳蛋白。这一结果表明所预测的AE肽段具有较好的免疫原性。     

Cloning and expression of the N-acetylmuramidase gene from Streptomyces rutgersensis H-46

The N-acetylmuramidase SR1 gene from Streptomyces rutgersensis H-46 was cloned in Escherichia coli JM109 and expressed in E. coli BL21(DE3)pLysS. An open reading frame included the leader peptide region encoding a polypeptide of 65 amino acid residues and the mature SR1 enzyme region encoding a polypeptide of 209 amino acid residues. The overall G + C content of the mature enzyme gene was 67.6%, with 98.1% of G or C in the third position of the codons. The calculated molecular weight of the mature enzyme was 23,057 Da. The amino acid sequence of the mature enzyme showed a significant level of identity with bacteriolytic enzymes from Streptomyces globisporus (50.9% identity), Chalaropsis species (40.2% identity) and Saccharopolyspora erythraea (31.0% identity). The mature enzyme gene cloned into plasmid pET26b carrying a signal peptide, peIB, was expressed in E. coli BL21(DE3)pLysS. The signal peptide region was cleaved during the production of the enzyme. Specific activity of the enzyme purified from the transformant was almost identical to that of the native enzyme. Furthermore, the SR1 enzyme gene cloned with the leader peptide gene into plasmid pET28a was also expressed in E. coli. In this case, a proform-like protein was partially processed; 35 amino acid residues were cleaved but 30 amino acid residues remained. This proform like protein has approximately one-nineteenth the activity of the native enzyme. These results indicated that the native SR1 enzyme was produced in the following manner in the cells of S. rutgersensis H-46. The SR1 enzyme gene was translated to a pre-proform protein followed by the deletion of a signal peptide. Finally, the proform-like protein was processed by deletion of the remaining leader peptide.     

基因共表达对人源LysoPLD异源可溶性表达、纯化及酶学性质的影响

目的:为实现人源溶血磷脂酶D（LysoPLD）的原核异源可溶性表达。方法:通过NCBI检索,确定人源LysoPLD基因序列（GenBank: L46720.1）。采用密码子优化后的序列,克隆至pET-28a表达载体中,采用共表达麦芽糖结合蛋白融合标签（MBP）和共表达促蛋白正确折叠分子伴侣触发因子Trigger factor（tig）两种方式提高LysoPLD蛋白在大肠杆菌中的异源可溶性表达,建立对应蛋白的纯化工艺包括离子柱纯化,硫酸铵盐析,疏水柱纯化,淀粉树脂柱（Amylose Resin）纯化,分离纯化获得的重组酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定蛋白纯度,以对羟基棕榈酸酯为底物对比两种蛋白的酶学性质。结果:成功构建载体pET28a-MBP-LysoPLD和pET28a-pTF16-LysoPLD,并获得工程菌BL21（DE3）-pET28a-MBP-LysoPLD和BL21（DE3）-pET28a-pTf16-LysoPLD。BL21（DE3）-pET28a-MBP-LysoPLD经0.6 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）低温诱导过夜可获得上清表达的MBP-LysoPLD蛋白;BL21（DE3）-pET28a-pTf16-LysoPLD在含有0.5 μg/mL L-Arabinose的LB培养基中培养,经0.1 mmol/L IPTG低温诱导表达,可获得可溶性表达的LysoPLD蛋白,经纯化,酶纯度可大于80%。以对羟基棕榈酸酯为底物,对比两种方法得到的蛋白的酶学性质,发现二者催化反应的最适温度、最适pH、最适Ca2+浓度、比酶活基本一致。结论:两种基因共表达方式都可实现人源LysoPLD的在大肠杆菌中的可溶性表达,且酶学性质基本相同。     

Thermomyces lanuginosus ZJB09222脂肪酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达

Thermomyces lanuginosus脂肪酶(简称TLL)是具有重要商业应用价值的脂肪酶之一。运用RT-PCR技术,从Thermomyces lanuginosus ZJB09222基因组中克隆得到885 bp脂肪酶基因cDNA序列,其结构基因编码蛋白包含292个氨基酸。将脂肪酶基因cDNA序列开放阅读框克隆到大肠杆菌表达载体pET-28b中,转化大肠杆菌BL21(DE3),构建了基因工程菌E.coli BL21/pET28b-TLL。诱导表达后SDS-PAGE电泳显示该脂肪酶分子量约为32 ku。筛选获得廉价重组菌培养基,表达条件优化结果表明,当OD600约为0.6～0.8时,加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L,在28℃诱导培养7 h,酶活达到41 U/mL。     

钝齿棒杆菌ArgR蛋白的表达、纯化及其多聚体的形成

通过PCR技术从钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)AS1.542基因组中扩增得到长度为516bp的argR基因,将其连接到原核表达载体pET22b(+),并转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌株BL21(DE3)/pET22b-argR,以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)在33℃诱导8h实现高效可溶性表达,获得了一个分子质量为20kD的融合蛋白ArgR。用纯化后的目的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA检测抗体效价高达1:160000。Western blot分析结果表明,L-精氨酸介导重组蛋白形成的多聚体,可与自制的鼠抗ArgR多克隆抗体进行特异性反应,与预期结果一致,表明ArgR通过与精氨酸共孵育形成了多聚体,该结果有助于采用凝胶阻滞方法对ArgR蛋白与钝齿棒杆菌精氨酸生物合成途径中各操作子的结合情况进行进一步研究。     

中性蛋白酶基因在大肠杆菌中诱导表达条件的研究

采用PCR方法从枯草芽孢杆菌中扩增得到中性蛋白酶基因npr,与表达载体pET-22b(+)连接构建成重组质粒pET22b-npr,转化大肠杆菌BL21得到重组工程菌株。经IPTG诱导,其所含有的中性蛋白酶基因可高效表达。研究不同的表达条件对中性蛋白酶表达水平的影响,发现当培养液的OD_(600)值达到0.6～0.8时,添加诱导剂IPTG至终浓度为0.8 mmol/L,28℃诱导7h,重组工程菌中性蛋白酶的表达量最高,SDS-PAGE电泳结果显示出明显的分子质量约43 ku的特异性蛋白条带。