基于CRISPR-Cas9系统的Saccharomyces cerevisiae基因删除

建立CRISPR-Cas9介导的在Saccharomyces cerevisiae双倍体细胞中进行基因敲除的方法。以can1基因敲除后的表型验证该CRISPR-Cas9系统的有效性,can1基因的失活效率达到4%。利用该系统又分别敲除了pdc、adh3、adh2、adh1、 pdh等基因,单基因编辑效率分别为4/48、3/48、1/48、3/28、1/16。确定了基因连续敲除的方法流程,pdc、adh3、adh2三个基因全部敲除,整个过程用时17 d。探索了双基因一次转化同时敲除的方法,将adh5、lip两个基因同时敲除用时6 d,基因编辑效率分别为9/32和10/32。     

CRISPR-Cas系统在食品微生物中的应用研究进展

成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其关联蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)构成CRISPR-Cas系统,该系统作为高效、灵活、易于操作的基因编辑技术,开始广泛应用于微生物基因组位点的靶向编辑中。本文针对CRISPR-Cas9系统在食品微生物领域,特别是在食品酿造微生物和食品病原微生物中的应用进行综述,并进一步讨论影响该系统基因编辑效率的主要因素及发展方向,为CRISPR-Cas9系统在食品微生物中的应用提供参考和依据。     

CRISPR-Cas系统在细菌基因组编辑和代谢调控中的研究进展

CRISPR-Cas系统已迅速发展成为高效、精确、简便的多功能基因组编辑及代谢调控工具,并被成功应用于多种细菌。继最具代表性的II型CRISPR-cas9系统后,更简单高效的V型CRISPR-Cpf1系统被开发出来。对这两者不起作用的宿主菌,可考虑采用CRISPR-cas9n或内源I型CRISPR-Cas系统。此外,CRISPR-dcas9、CRISPR-ddCpf1及内源I型CRISPR-Cas系统可用于基因代谢调控。该文从CRISPR-Cas系统的结构、分类、作用机理、各类CRISPR-Cas系统介导的细菌基因组编辑和基因表达调控等方面进行综述,并对CRISPR技术的发展进行了展望。     

CRISPR-Cas9筛选系统在病毒宿主作用因子鉴定中的优势

CRISPR-Cas9系统是细菌和古细菌中进化出的适应性免疫防御系统,称为簇状规则间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR),该系统被开发为一种基因组编辑技术并已广泛应用于病毒与宿主互作基因的筛选,2015年通过CRISPR-Cas9全基因组敲除细胞文库筛选鉴定了HRD1,EMC2等基因为西尼罗河病毒(WNV)的宿主互作基因[1]。由于病毒具有一定的传播特性,加上一些病毒的特异性受体未知,入侵机制不明,未来可能会威胁牲畜、公共卫生甚至威胁人类安全。因此,人类必须重视病毒与宿主细胞的相互作用研究,本文通过对CRISPR-Cas9系统筛选法与其他筛选方法在病毒宿主作用因子中的应用进行总结与比较,为后续科研人员在方法学上的选择提供一定参考。     

乳酸杆菌改良技术的新进展

本文综述近年食品相关的微生物研究方面的技术进展和新方法。通过这些方法，可以对已有的食品微生物进行技术改造，尤其是对乳酸杆菌的工业化生产菌株进行技术改造。同样，这些方法在对抗那些导致食品腐化变质的有害微生物方面，也有重要指导意义。     

乳酸杆菌表层蛋白基因结构及功能研究进展

乳酸杆菌对宿主的黏附性是其发挥益生作用的基础,而其黏附性与自身的表层蛋白密切相关。乳酸杆菌表层蛋白具有相对分子质量低、高等电点、结构和基因的多样性等特点。国内外学者对于乳酸杆菌的表层蛋白进行了深入的研究。作者从乳酸杆菌表层蛋白的基因结构和特性、和生物学功能几个方面对乳酸杆菌表层蛋白进行了综述。     

乳酸杆菌抗肿瘤作用的研究进展

乳酸杆菌是一种对人体健康和微生态平衡很重要的益生菌,广泛分布在人体的胃肠道和生殖道中,近些年来研究发现,乳酸杆菌在预防和治疗肿瘤方面表现出积极作用。本文主要综述了乳酸杆菌对多种肿瘤的抑制作用,以及乳酸杆菌通过抑制致癌物质生成、激活体液免疫、激活细胞免疫和促进肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤作用机制,为乳酸杆菌在抗肿瘤方面的进一步研究提供理论基础。随着乳酸杆菌在抗肿瘤方面的深入研究,对新型抗肿瘤药物的开发和生物技术防治肿瘤的发展具有重要的意义。     

利用CRISPR-Cas9和Cre/loxP系统删除34个非必需基因构建L-苏氨酸生产菌

L-苏氨酸是一种被广泛应用于食品、饲料及医药等领域的必需氨基酸。大肠杆菌以葡萄糖为碳源合成L-苏氨酸的过程中,一些非必需基因的转录和翻译会消耗碳源。利用CRISPR-Cas9和位点特异性重组系统Cre/loxP,敲除了大肠杆菌MG1655基因组中puuE和ynaI区间的34个非必需基因（共30.372 kb）,获得了突变菌MG003,然后通过高表达L-苏氨酸合成途径中关键基因thrA*、thrB和thrC以及L-苏氨酸转运酶编码基因rhtA和rhtC提高L-苏氨酸产量。与对照菌MG1655/pFW01-thrA*BC相比,MG003/pFW01-thrA*BC生长加快,L-苏氨酸产量提高25.5%;MG003/pFW01-thrA*BC-rhtA的L-苏氨酸产量提高了43.3%;MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC的L-苏氨酸产量提高了74.5%。研究结果表明,大肠杆菌基因组中34个非必需基因的删除有利于其提高L-苏氨酸合成能力。     

乳酸杆菌表层蛋白及应用研究

在一些古细菌和真细菌中,表层蛋白是细胞膜最外层的结构。尽管所有表层蛋白具有相同的氨基酸成分,但是与其他细菌表层蛋白相比,乳酸杆菌表层蛋白具有其独有的特性:小分子量,高等电点,为碱性蛋白。一些乳酸杆菌具有多个表层蛋白基因。国外学者对表层蛋白作为功能分子共价吸附固定的基质、表面展示载体和分子筛等方面的应用进行了深入研究,展示了巨大的发展前景。     

乳酸杆菌的专利分析

乳酸杆菌在市场上有着广泛的应用,通过对国内外乳酸杆菌专利信息的检索和整理,本文分别从专利申请量、申请人国别、主要申请人、中国专利申请人地域分布、专利的法律状态和有效性及专利转让趋势进行分析,以期为我国乳制品企业及科研机构制定专利战略布局提供依据。     

Bioconversion of anthocyanin glycosides by Bifidobacteria and Lactobacillus

Eight strains of Lactobacillus plantarum, 6 strains of Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus LA-5, and Bifidobacterium lactis BB-12 were screened for β-glucosidase activity. We then proceeded to investigate the enzymatic potential of selected strains for bioconversion of delphinidin and malvidin glycosides to their metabolites. L. plantarum and L. casei strains showed the highest cell-envelope associated β-glucosidase activity. Intracellular β-glucosidase activity from B. lactis BB-12 was up to 287-fold higher than that of the other strains. The L. acidophilus strain showed low β-glucosidase activity, both, intra and extracellularly. No aglycons were detected in bacterial extract reactions with anthocyanin glycosides. Delphinidin-3-glucoside underwent chemical degradation to form mainly gallic acid, although delphinidin-3-glucoside degradation due to B. lactis BB-12 and enzymatic activity towards chemically-formed metabolites due to L. casei LC-01 were observed. Incubation of malvidin-3-glucoside with B. lactis BB-12, L. plantarum IFPL722, and L. casei LC-01 cell-free extracts led to different patterns of gallic, homogentisic and syringic acid formation.     

酶法联合超声技术制备灵芝寡糖及其对乳酸杆菌的增殖作用

为探究酶解联合超声法制备灵芝寡糖的最佳工艺及灵芝寡糖对乳酸杆菌的增殖作用。以灵芝水提物为原料,优化了酶解和超声条件,对比了原料液和酶解联合超声处理后经3000 Da超滤膜处理所得寡糖得率和结构的差异,分析了其对乳酸杆菌的体外增殖作用。结果表明,酶解条件为酶解时间9 h、温度50 ℃、pH5、酶用量1000 U/g底物、超声时间60 min、超声功率480 W时,灵芝寡糖得率最高,为1.76%,比原料液中提高了61.46%。经傅里叶红外光谱分析,灵芝寡糖样品具有典型的β-型糖苷键特征和吡喃环化合物的特征。乳酸杆菌增殖实验表明灵芝寡糖对乳酸杆菌具有良好的增殖效果,且其增殖效果优于灵芝多糖。实验为灵芝寡糖的制备及其应用于功能性食品的开发提供了依据。     

可降胆固醇的优势乳杆菌筛选

为丰富降胆固醇、降血糖的益生菌资源,以实验室10株潜力益生菌株为实验对象,进行体外降胆固醇能力、胆盐水解酶(BSH)活性及α-葡萄糖苷酶抑制率试验,测定菌株对人工胃液和胆盐的耐受性,评价优势菌株的细胞黏附性能及对抗生素的耐药安全性能。结果表明,植物乳杆菌LH-511、植物乳杆菌10-12、植物乳杆菌10-4对胆固醇的降解率在50%以上,显著高于商业菌株植物乳杆菌299V(p<0.05)。植物乳杆菌10-12、植物乳杆菌SD-H9对α-葡萄糖苷酶的抑制率高达41.7%、40.1%。植物乳杆菌LH-511、植物乳杆菌10-12、植物乳杆菌10-4、植物乳杆菌10-14、卷曲乳杆菌OF48-2pH5这5株菌具有较好的BSH活力、α-葡萄糖苷酶抑制性、抗逆性以及对HT-29细胞的黏附能力。但仅植物乳杆菌LH-511和卷曲乳杆菌OF48-2pH5通过了10种抗生素的安全性试验。综上所述,植物乳杆菌LH-511和卷曲乳杆菌OF48-2pH5具有较好的降胆固醇、降血糖潜力,且通过了抗逆性、黏附性、安全性试验,可用于进一步的开发和应用。     

非活性双蛋白乳酸菌饮料配方的优化

以大豆分离蛋白和脱脂乳粉为原料,研制具有独特风味和营养价值的非活性双蛋白乳酸菌饮料。采用单因素和正交实验法对非活性双蛋白乳酸菌饮料的配方进行优化,以感官评分为指标,考察了脱脂乳粉、大豆分离蛋白粉、白砂糖及柠檬酸添加量对饮料感官评分的影响。实验结果表明:脱脂乳粉添加量2%、大豆分离蛋白粉添加量1%、白砂糖添加量8%以及柠檬酸添加量0.25%时,感官评分为97分,在此条件下研制出的非活性双蛋白乳酸菌饮料酸甜适口、风味独特、口感饱满,且具有丰富的营养价值。     

产叶酸乳酸菌的筛选及对发酵乳的影响

为筛选出高产叶酸的乳酸菌并研究该乳酸菌对发酵乳的影响,采用高效液相色谱(HPLC)法从5种乳酸菌菌株:植物乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌的发酵液中检测叶酸含量,并通过检测复合发酵乳的pH、持水力、质构特性和感官特性来研究产叶酸的乳酸菌对发酵乳品质的影响。结果表明:植物乳杆菌产叶酸量最高,其次是嗜酸乳杆菌,分别为51.40和34.77 μg/mL。并且以基础菌发酵乳为对照组,添加产叶酸乳杆菌发酵乳为实验组,实验组与对照组相比,其质构特性和感官品质会提高,同时pH也显著下降(p<0.05)。本实验为开发功能性发酵乳提供了一定的理论依据。     

乳酸菌发酵对螺旋藻主要功效成分影响的初步研究

为研究乳酸菌发酵对螺旋藻功效成分的影响,本研究选用植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和凝结芽孢杆菌分别对螺旋藻进行发酵处理(发酵条件为37℃,72 h),分析了四种乳酸菌发酵处理后的螺旋藻发酵上清液和发酵固形物醇提液的主要功效成分的含量变化,并对其进行了抗氧化活性测定。研究表明,利用各菌种进行螺旋藻发酵后的上清液中总酚含量显著增加(P<0.05),其中植物乳杆菌处理增幅最高可达39.8%;干酪乳杆菌处理上清液中总黄酮含量显著增加(P<0.05),增幅为41.3%;不同菌种发酵固形物醇提液中总酚、藻蓝素和类胡萝卜素含量显著下降(P<0.05),其中总酚下降幅度为22.5%~30.1%,藻蓝素为97.5%~99.5%,类胡萝卜素为86.9%~94.5%,然而发酵上清液对DPPH·的清除能力提高了5.6%~6.5%,发酵固形物醇提液对DPPH·的清除能力提高了7.4%~8.3%,表明发酵过程中可能产生了新的抗氧化成分。此外,不同菌种之间发酵上清液和固形物的主要活性成分和抗氧化活性均具有明显差异,表明乳酸菌菌种对于螺旋藻发酵代谢产物具有重要影响。     

Selection and Characterisation of Lactobacillus and Bifidobacterium Strains for Use as Probiotics

A large culture collection of lactic acid bacteria held at NZDRI (of over 2000 strains) was screened to select strains with functional characteristics typical of probiotic bacteria. Selection criteria employed included the ability of strains to withstand environmental conditions similar to the digestive tract as well as specific biological activites. Following an initial screening of over 200 strains selected from the collection, four strains were identified as putative probiotic strains. Three of the selected strains were of dairy origin and one was of human origin. These strains were able to survive at low pH and relatively high bile concentrations and compared favourably in these respects to two commercial probiotic strains namely Lactobacillus rhamnosus GG and Lactobacillus acidophilus LA-1. Of the 200 strains studied, a higher proportion of strains of human origin were found to be resistant to both low pH and high concentrations of bile as compared to strains of dairy origin. The four putative probiotic strains were characterised by classical microbiological techniques and molecular methodologies including DNA–DNA homology, SDS–PAGE analysis of whole cell proteins, PFGE, species-specific probes and RAPD. The strains were identified as Lb. rhamnosus HN001 (also known as DR20), Lb. acidophilus HN017, Lb. rhamnosus HN067 and Bifidobacterium. lactis HN019 (also known as DR10).     

嗜酸乳杆菌表层蛋白提取方法的对比

本文通过电泳比较了5 mol/L LiCl法、4 mol/L盐酸胍法、8 mol/L尿素法和5 mol/L LiCl结合1 mol/L LiCl法提取嗜酸乳杆菌JCM 1132表层粗蛋白方法,并进一步研究了不同提取方法对乳杆菌表面特性的影响。结果表明:两种不同浓度的LiCl法是提取表层蛋白的最适方法,该方法提取可得到纯度较高的表层蛋白。且用该方法剥离表层蛋白后,菌体的存活率最高,约为99.27%。不同方法去除表层蛋白后,菌体的表面电荷、表面疏水性、自聚集能力以及与沙门氏菌的共聚集能力均有所降低。表明表层蛋白对嗜酸乳杆菌表面性质起关键性作用,对乳杆菌益生功能的积极影响。     

组学技术在红曲霉研究中应用的进展

组学技术的发展拓展了人们对红曲霉生长发育、代谢产物的合成及代谢调控机制的认知。总结了近年来红曲霉组学研究的现状及热点问题,从基因组学、转录组学、蛋白质组学及代谢组学等多个维度剖析了组学技术在红曲霉研究中的应用状况。基因组学主要用于探讨红曲霉的进化地位、基因簇的预测与挖掘、同源基因的比对及代谢途径分析等;红曲霉生长和代谢过程中基因或基因簇的转录表达、代谢调控机制及新转录调控因子的预测和挖掘是转录组学的应用范围;蛋白质组学主要涉及红曲霉代谢过程中重要酶类的功能解析及其参与代谢产物的机制解析;而代谢组学则以红曲霉代谢产物为基础,解析其潜在的代谢机制。阐述了红曲霉代表性次级代谢产物之一——红曲色素在研究和生产中面临的问题,并围绕调控红曲色素生产的高效化、精细化、安全性等方面,总结了基于组学技术的菌种选育、培养基优化、化学和物理因素调节及菌株的代谢改造等调控技术。对综合运用组学技术围绕红曲色素代谢调控的研究提出了展望,以期为推动红曲霉研究及其代谢产物的生产提供参考。