ISSR标记在扁玉螺中的初步应用

以扁玉螺基因组DNA为材料,分析了Mg2 、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物以及模板DNA浓度对ISSR-PcR扩增效果的影响,建立了一套适合扁玉螺的ISSR-PCR反应体系.该反应体系包括:2.0mmol/L的Mg2 ,0.25mmol/L的dNTP,0.8U的Taq DNA聚合酶,0.2μmol/L的ISSR引物和40ng模板DNA.利用优化后的反应体系,从30条ISSR引物中筛选出了13条扩增效果较好的引物,这为进一步利用ISSR标记研究扁玉螺的遗传多样性打下了基础.     

In-Fusion克隆技术构建HBVX基因真核表达质粒

目的以血清中乙型肝炎病毒（HBV）DNA 为模板,克隆构建HBV X 蛋白质的真核表达载体pcDNA-HBx.方法：设计扩增HBV X 基因的In-Fusion PCR 引物,采用高保真DNA 聚合酶分两段扩增HBV X 基因序列;采用In-Fusion 克隆技术,将两段X 基因扩增片段-步克隆入经Hind Ⅲ 和Xba I 双酶切的pcDNA3.0 真核表达载体,以构建重组真核表达载体pcDNA-HBX ;采用Hind Ⅲ 和Xba I 双酶切和DNA 序列测序筛选鉴定重组载体;pcDNAHBx转染HepG2 细胞,Western blot 检测pcDNA-HBx 转染细胞的HBx 蛋白质表达.结果：In-Fusion PCR 引物分两段扩增获得全长HBx 基因序列;In-Fusion 获得克隆的pcDNA-HBx 经双酶切筛选得到阳性重组质粒,测序分析证实插入序列正确;转染pcDNA-HBX 的HepG2 细胞,Western blot 证实表达HBx 蛋白质.结论：以血清HBV DNA 为模板克隆HBV X 基因,构建了表达HBV HBx 蛋白质的真核表达载体,为HBx 蛋白质的生物学功能研究提供支持.     

聚合酶链反应（PCR）技术与基因扩增分析仪器（PCR仪）

较为全面地论述了聚合酶链反应(PCR)技术与基因扩增分析仪器(PCR仪).较为详细地阐述了PCR基本原理、PCR结果的检测与分析、实时定量PCR技术、影响PCR效果的因素、PCR技术的应用、PCR仪器的现状及其发展方向.     

利用微量荧光计测定DNA含量和PCR产物

建立了一种利用微量荧光计定量测定双链DNA及PCR扩增产物的简便方法。在dsDNA含量为5～250ng的范围内,荧光强度与dsDNA含量呈线性关系。用此法测定PCR产物量时,荧光信号不受石蜡油或反应混合物中剩余产物及4×dNTP的干扰,因为这些成份均非双键DNA。本法试用于临床检验,定量测定乙型肝炎病毒DNA及PCR扩增产物,测定结果与用目测电泳胶中溴乙锭带亮度的半定量法符合良好。     

In-Fusion克隆技术构建HBV X基因真核表达质粒

目的 :以血清中乙型肝炎病毒(HBV)DNA为模板,克隆构建HBV X蛋白质的真核表达载体pcDNA-HBx。方法 :设计扩增HBV X基因的In-Fusion PCR引物,采用高保真DNA聚合酶分两段扩增HBV X基因序列;采用In-Fusion克隆技术,将两段X基因扩增片段一步克隆入经Hind III和Xba I双酶切的pcDNA3.0真核表达载体,以构建重组真核表达载体pcDNA-HBX;采用Hind III和Xba I双酶切和DNA序列测序筛选鉴定重组载体;pcDNAHBx转染HepG2细胞,Western blot检测pcDNA-HBx转染细胞的HBx蛋白质表达。结果 :InFusion PCR引物分两段扩增获得全长HBx基因序列;In-Fusion获得克隆的pcDNA-HBx经双酶切筛选得到阳性重组质粒,测序分析证实插入序列正确;转染pcDNA-HBX的HepG2细胞,Western blot证实表达HBx蛋白质。结论 :以血清HBV DNA为模板克隆HBV X基因,构建了表达HBV HBx蛋白质的真核表达载体,为HBx蛋白质的生物学功能研究提供支持。     

实时数字PCR扩增曲线的分类

传统的数字PCR检测仅针对扩增终点的核酸样本执行终点式的荧光分析,依据反应后的荧光图像进行阴阳性统计及样本浓度计算,分析结果极易受假阳性及非特异性扩增影响。本文提出了一种基于过程的实时微孔式数字PCR芯片阴阳性分析方法,从时间维度对数字PCR结果进行定量分析,提高数字PCR检测的准确性。设计支持实时数字PCR分析的硬件系统并与终点式数字PCR仪进行对比,验证系统性能。在此系统上检测不同浓度的人类Ⅳ型疱疹病毒样本,获取实时扩增曲线,采用支持向量机算法对扩增曲线的特征进行学习并应用于检测曲线分类。实验结果表明,所设计的实时数字PCR系统与终点式数字PCR仪扩增结果具有高度一致性。本文所述的基于支持向量机的分类算法对扩增曲线的分类准确率达到98%以上,能准确识别假阳性及非特异性扩增微孔。相比于传统阈值分割法,本方法对阳性点识别的平均准确率提高了17.60%,并且目标模板拷贝数越低,效果越明显。与传统的终点式数字PCR相比,本文提出的基于实时数字PCR系统的数据分析方法具有准确性更高的优势,尤其在低拷贝数检测下可以获取更为精确的定量结果。     

分子标记在中药研究中的应用

DNA分子标记是继形态标记、细胞学标记、生化标记之后发展起来的一种新的更为理想的遗传标记,其在中药研究中发挥了重要作用.DNA分子标记包括以分子杂交(southern杂交)为基础的DNA分子标记技术、以PCR为基础的DNA分子标记技术和以DNA序列为基础的分子标记技术.本文对DNA分子标记的分类、原理及其在中药研究中的应用进行了综述.     

荧光标记DNA分子量内标的设计与制备

目的:设计并制备65bp-500bp范围的荧光标记DNA分子量内标。方法:p MD18-T Vector连接任意一段割胶回收的DNA片段,克隆后提取重组质粒经双酶切后作为模板,在其上游设计一条固定引物并用荧光标记,在其下游设计一系列引物,经PCR扩增后在ABI 3100遗传分析仪上检测。结果:扩增产物DNA片段大小分别为65bp、105bp、149bp、200bp、241bp、269bp、311bp、345bp、400bp、450bp、500bp,与预期片段大小一致。结论:11个片段经混合调平后,峰型良好,出峰位置均匀,可用于毛细管电泳中DNA片段大小的确定。     

法医DNA提取纯化试剂盒在Hamilton Microlab(R) Starlet DNA自动提取仪上的应用研究

本文利用自主研制的法医DNA提取纯化试剂盒在Hamilton Microlab(R)Starlet DNA自动提取仪上提取276份血斑样本DNA,PCR扩增检测到270份样本STR分型,成功率达97.8%.结果表明法医DNA提取纯化试剂盒可与国外进口的DNA自动提取仪相配伍进行血斑样本的批量提取.     

实时荧光定量PCR技术在动物遗传育种中的应用

聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction简称PCR)是一项体外基因快速扩增技术.该技术的建立,使定性检测的技术得到改善,达到检测单个靶细胞的水平,以其简便易行、灵敏度高等优点被广泛应用于分子生物学及医学等领域.但其易污染、假阳性及定量不准确等问题也日益突出.而荧光定量PCR技术(FQ-PCR)的出现解决了以上难题,实现了从定性到定量的飞跃.此方法特异性强和可靠性更强,能实现多重反应,且采用完全闭管检测,不需要PCR后处理,有效解决PCR污染问题以及EB对试验人员的伤害;再配以相应的荧光PCR仪,使整个PCR过程实现自动化,具有耗时短,操作方便等特点,因而广泛运用于各个领域.