圆弧青霉脂肪酶基因的克隆和表达

圆弧青霉PG37总RNA甲醛变性电泳呈现真核生物所特有的 2 8SrRNA和 18SrRNA条带 .根据PG37所产碱性脂肪酶 (LipPC)N末端氨基酸残基序列和真核生物mRNA在 3’端具有poly(A)等所提供的生物信息 ,采用RT PCR技术扩增了LipPC成熟肽和 3’非编码区的cDNA片段 ,并将该PCR产物直接克隆至pUCm T载体中 .序列分析表明 ,LipPC含有 2 5 8个氨基酸残基 ,其中保守的五肽序列为Gly His Ser Leu Gly .进一步采用ClonTech公司的SmartTM PCRcDNA文库构建试剂盒 ,扩增、克隆和测定了自转录起始点至编码区的cDNA片段 ,从而完成了LipPC完整cDNA的分析测定 .最后将编码完整脂肪酶蛋白质的cDNA克隆至 pGEX 5X 3表达载体中 ,SDS PAGE检测结果表明 ,大肠杆菌BL2 1所表达的GST LipPC融合蛋白质分子质量约为 5 3ku .     

碱性脂肪酶的高效液相色谱和质谱分析

以常压层析系统纯化的碱性脂肪酶为出发蛋白,采用高效反相色谱对其进一步分离纯化,达到N末端氨基酸测序及肽谱分析所需的纯度.用电喷雾质谱测得脂肪酶的相对分子质量为27 217±1.对该脂肪酶的胰蛋白酶水解条件及肽段的相对分子质量等进行了研究.     

柠檬酸发酵的生物化学机制

<正> 关于柠檬酸发酵的生物化学机制,walKer、陈騊声、照井造尧、Prescoot、和Martin曾作过专门的综述。十几年来这方面的研究又取得迅速进展。本文将从代谢途径、酶活力变化、代谢调节、和细胞透性等几方面介绍柠檬酸发酵生化机制研究的进展。 一、代谢途径     

平板扩散法粗略确定碱性脂肪酶的活性

通过对圆弧青霉PG3 7所产碱性脂肪酶活性测定方法的研究和比较 ,建立了一种快速、直观、灵敏的固体琼脂平板脂肪酶活性测定方法 .利用脂肪酶在一定条件下分解三丁酸甘油酯所释放出的游离脂肪酸使指示剂 (维多利亚蓝 )变色的原理 ,根据变色圈直径的大小对酶活性进行粗略分析 ,特别适合于酶提纯过程中大批量样品酶活性的估测以及酶活性条带和其它蛋白质条带的区分 .     

碱性脂肪酶同工酶的分离纯化

对经疏水层析 (PhenylSepharoseCL 4L)和阴离子交换层析 (DEAE FastFlow)等部分纯化的样品 ,采用制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步将其分离纯化 ,获得了PG3 7碱性脂肪酶的 3种同工酶LipaseⅠ、LipaseⅡ和LipaseⅢ .用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳和SephadexG 1 50凝胶色谱法分别测得同工酶的相对分子质量为 2 750 0和 2 90 0 0 .测定了LipaseⅠ的等电点为 5.4 ,动力学常数Km 和Vmax分别为 4 .54g/dL和 5.56μmol/ (min·μg) .