HEK 293细胞中重组型抗体表达和分泌的监测系统的构建

免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)作为一种十分重要的生物药物,已被广泛应用于多种医学诊断和治疗。为构建高效表达重组抗体的哺乳动物生产菌株,运用可以灵活检测抗体分泌运输的表达细胞株,从而充分理解抗体的折叠、转运及分泌尤为重要。作者在哺乳动物细胞株(HEK 293)中构建了一个稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)融合型抗体E-F-HyHEL10的表达系统,可通过流式细胞术检测抗体的分泌运输。此哺乳动物细胞表达系统具有良好的抗体表达和分泌水平,且稳定维持了抗体的功能活性。使用布雷菲德菌素A(brefeldin A)和放线菌酮处理细胞后,来自胞内E-F-HyHEL10的GFP荧光信号与抗体分泌水平呈正相关。结果表明,本研究中构建的抗体表达系统可实现抗体表达、累积和分泌水平的灵活准确监测,未来可应用于哺乳动物细胞中抗体分泌相关因子的筛选。     

利用PiggyBac转座子系统快速控制GPI锚定蛋白的表达

GPI锚定蛋白的合成是一个发生在内质网中多步骤、多基因参与的过程。PIGK是GPI锚定蛋白转酰胺酶复合物的一个催化亚基,负责把GPI前体转移到蛋白质上。作者在人体胚胎肾细胞(HEK 293)中获得了PIGK敲除的细胞株,敲除PIGK的细胞不能表达GPI锚定蛋白。利用piggyBac(PB)转座子系统,在细胞中重新插入PIGK基因,细胞膜表面的GPI锚定蛋白恢复表达。实验成功构建了HEK293pB-PIGK细胞株并命名为G36,通过引入PB转座酶或FLP重组酶,可以控制GPI锚定蛋白的表达。本系统可以快速调控细胞表面蛋白质的表达并能够用于基础研究和工业应用。     

酿酒酵母中PiggyBac转座子筛选系统的构建

PiggyBac(PB)是来源于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的TTAA型转座子。PB转座子系统可作为一种插入型突变工具,应用于多种真核细胞中。本研究在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中构建了一个基于PB转座子的筛选系统。系统由插入ADE2基因编码框的PB转座子及由半乳糖启动子调控表达的PB转座酶(PBase)两部分组成。在PBase诱导下,PB转座子可以从原始位点无痕移除并随机插入新的基因位点。PB转座子在转座过程中保持单一拷贝数,在每个突变细胞中只有一个插入位点,并可快速检测突变基因。实验结果表明:所构建的PB转座子筛选系统可应用于酿酒酵母中的基因筛选。