cp4-epsps基因在毕赤酵母中的表达及鉴定

为建立一种新的外源蛋白安全评估方法,构建转外源基因酵母是关键步骤。本研究以来源于转基因作物的抗除草剂合成酶蛋白CP4-EPSPS为研究模板,首先通过基因优化和化学合成获得cp4-epsps基因,优化后基因密码子适用性指数(CAI)为0.85,GC含量为52%。目的基因克隆至毕赤酵母表达载体p PICZb,经鉴定筛选正确的重组载体p PICZb-EPSPS电击转化至毕赤酵母GS115,cp4-epsps基因通过同源重组方式整合至酵母基因组,PCR扩增酵母基因组筛选得到在正确位点发生同源重组的4株阳性菌株。随后,各阳性菌株分别于28℃、250~300 r/min培养,0.5%甲醇诱导4 d后,提取各组菌株总蛋白,采用SDS-PAGE和western blotting鉴定CP4-EPSPS表达的正确性。CP4-EPSPS单克隆抗体及载体标签C-MYC单克隆抗体的western blotting结果一致显示cp4-epsps基因在毕赤酵母GS115中成功获得表达,大小约50 ku。本实验成功构建了转cp4-epsps基因的毕赤酵母基因工程菌,为下一步开展转基因作物CP4-EPSPS成份的安全评价奠定基础。