基于热不稳定区段分析和二硫键预测的玉米赤霉烯酮脱毒酶ZLHY-6热稳定性改造

目的 脱毒酶ZLHY-6的热稳定性较低, 严重制约了其在食品和饲料工业上的应用, 所以期望通过定点突变改造提高ZLHY-6的热稳定性。方法 本研究基于分子动力学模拟, 设计了两个策略以提高热稳定性。策略一: 寻找ZLHY-6热不稳定区段, 对区段内氨基酸进行计算机虚拟饱和突变, 根据突变自由能变(ΔG)筛选结果选取了10个突变体。策略二: 通过预测, 在ZLHY-6分子内引入二硫键, 每个突变体引入1对, 共计5个突变体。结果 突变体H134W和Q45C/A253C在45℃ 热处理20 min后, 其相对酶活分别为野生型的10倍和3.1倍, 并保留了对ZEN一定的活性(41.33%、102.67%)。通过分子动力学分析和结构模拟发现, 突变的引入可能削弱了构象的波动性, 提升了结构刚性, 从而提升了蛋白的热稳定性。结论 热不稳定氨基酸突变和二硫键构建在脱毒酶ZLHY-6改造上具有可行性,ZLHY-6热稳定性的增强提高了其在工业上的应用潜力, 这一结果也为探索酶的计算机辅助手段改造提供策略基础。     

转录因子UstR调控黄曲霉毒素的合成及其生物学功能研究

目的 明确黄曲霉中Zn(II)2Cys6转录因子稻曲菌素B调控蛋白R (Ustiloxin B biosynthesis protein R,UstR)功能,解析UstR对黄曲霉生长、次级代谢和黄曲霉毒素(aflatoxin,AF)合成的调控。方法 本研究利用聚乙二醇介导的同源重组构建ustR基因缺失突变体;比较敲除突变体和野生型菌株在黄曲霉生长发育、胁迫响应、侵染能力、AF合成以及次级代谢产物合成等方面的差异,并通过ELISA试剂盒测定AF合成底物变化,利用RT-qPCR验证AF合成相关基因的转录水平改变,明确转录因子UstR对AF合成的调控作用。结果 基因敲除突变体的分生孢子形成受抑制,孢子产量降低,但菌核形成能力显著提高;ustR缺失不影响黄曲霉细胞壁完整性、胁迫响应能力以及侵染能力;UstR能够影响黄曲霉多种次级代谢产物产量,其中UstR通过正调控AF合成基因簇表达影响AF生物合成。结论 UstR是黄曲霉重要的Zn(II)2Cys6 转录因子,调控黄曲霉生长发育及AF产生,研究进一步完善了AF合成调控网络,为AF污染防控提供了新的防控潜在靶点。