海刺参组织蛋白酶L基因的克隆、重组表达及活性鉴定

通过RT-PCR和RACE PCR技术,从海刺参(Stichopus japonicus)肠中克隆得到编码组织蛋白酶L(SjCL)基因,其中全长cDNA 1 287 bp,5′非编码区(UTR)202 bp,3′UTR 87 bp,开放阅读框(ORF)999 bp,编码332个氨基酸(aa),包括组织蛋白酶L成熟肽316 aa和信号肽16 aa,分子质量预测为35.3 ku。用SjCL序列与相似物种海胆、海葵等进行对比,可知SjCL具有组织蛋白酶L所特有的氨基酸保守区域ERFNIN和GNFD,以及由Cys 139,His 278和Asn 299残基组成的保守活性位点。将编码SjCL基因克隆进原核表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒pET32a(+)-SjCL,转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞,再进行诱导表达、亲和纯化和透析复性,得到了纯化且具有活性的重组SjCL。酶活力检测结果表明,重组SjCL对组织蛋白酶L特异性底物Z-Phe-Arg-Nmec具有较高活性,而对组织蛋白酶B特异性底物Z-Arg-Arg-Nmec无活性。本实验对SjCL的cDNA序列进行了生物信息学分析并通过基因工程...     

仿刺参溶菌酶在重组酿酒酵母中的表达

采用酿酒酵母MKP-0表达仿刺参溶菌酶蛋白(AjLys)。以质粒pMD18-AjLys为模板,PCR扩增将组氨酸标签His-tag克隆到AjLys基因的N末端,构建克隆载体pMD18-His6-AjLys。根据密码子偏好性,通过定点突变对AjLys蛋白第69、77和95位的3个精氨酸的密码子进行优化,得到克隆载体pMD18-His6-AjLys(Δ69,77,95)。经SpeⅠ/BglⅡ酶切,构建重组表达质粒pESC-LEU-His6-AjLys和pESC-LEU-His6-AjLys(Δ69,77,95)。基因工程菌pESC-LEU-His6-AjLys(Δ69,77,95)/MKP-0通过半乳糖诱导72h后,Western Blot检测结果表明其成功表达了AjLys蛋白。抑菌实验结果表明,AjLys蛋白对溶壁微球菌具有一定的抑制作用。本实验成功构建了AjLys的酿酒酵母表达载体,并可在MKP-0细胞中表达了具有活性的AjLys蛋白,为AjLys的生产提供了一种具有可行性的新方法。     

两种EM菌剂对养殖水体水质及幼刺参生长性能的影响

研究了两种不同浓度的EM菌剂对养殖水体水质、幼刺参生长性能的影响。实验设5个处理组,其中1组为空白对照组;其余4个处理组分别投喂EM菌剂工大2号0.5×109、1.0×109 cfu/mL、工大3号0.5×109、1.0×109 cfu/mL。实验周期30d,实验期间不倒池。结果表明,与空白对照组相比,4个处理组水体的COD、非离子氨、亚硝酸盐、硫化氢均低于空白对照组。投喂0.5×109 cfu/mL工大2号和0.5×109 cfu/mL工大3号EM菌剂对水体净化效果均显著。与空白对照组相比,4个处理组的增重率分别提高了101.4%、78.2%、60.7%和49.4%。综合考虑海参的生长性能和水质,0.5×109 cfu/mL工大2号EM菌剂在有效改善水质的同时又可以显著提高海参的增重率,是较理想的微生态制剂。     

重组仿刺参超氧化物歧化酶在大肠杆菌中表达条件的优化及分离纯化

利用基因工程菌BL21(DE3)/pET30a(+)-SOD1,优化表达重组仿刺参超氧化物歧化酶蛋白(rAj-SOD1)。采用摇瓶发酵优化rAj-SOD1可溶性表达的条件,提高蛋白的表达产量。结果表明,在温度30℃、转速200 r/min、0.1 mmol/L IPTG诱导8 h条件下,菌体中rAj-SOD1蛋白表达量最大,达到315.59 mg/L。电泳检测结果表明,rAj-SOD1的纯度为96.7%,符合后续酶活要求。纯化后rAj-SOD1质量浓度为98.73 mg/L,收率为31.28%。邻苯三酚法对rAj-SOD1蛋白进行活性分析,结果表明,纯化的rAj-SOD1蛋白具有明显的抗氧化活性。     

饲料中添加木聚糖酶对刺参幼参生长、消化和体腔液酶活力的影响

为探讨木聚糖酶添加量对刺参Apostichopus japonicus生长、体成分、消化酶和体腔液酶活力的影响,在饲料中添加不同水平(0、0.03%、0.06%、0.09%、0.12%和0.24%)的木聚糖酶制成6种等氮等能试验饲料,试验设6组,每组设3个平行,每个平行放体质量为(7.73±0.09)g的幼参50头,分别用6种饲料进行投喂,共进行56 d养殖试验。结果表明:饲料中添加木聚糖酶显著提高了幼参增重率和特定生长率(P<0.05),且0.09%木聚糖酶添加组显著高于其他各组(P<0.05),各添加组增重率与对照组相比均显著提高(P<0.05);木聚糖酶添加组幼参体壁粗蛋白质含量显著高于对照组(P<0.05),0.06%～0.24%木聚糖酶添加组幼参粗脂肪含量显著高于对照组(P<0.05);0.06%～0.12%木聚糖酶添加组肠道蛋白酶活力显著高于对照组(P<0.05),0.24%添加组淀粉酶活力显著高于其他各组(P<0.05);幼参体腔液中溶菌酶、过氧化氢酶、谷草转氨酶和谷丙转氨酶活力均随木聚糖酶添加量的增加呈先升高后降低的趋势,0.06%～0.12%添加组显著高于对照组(P<0.05)。研究表明,饲料中添加木聚糖酶可显著提高刺参生长、体成分、消化酶和体腔液酶活力,以增重率为评价指标,折线回归分析得出,对平均体质量为(7.73±0.09)g的刺参,其饲料中木聚糖酶最适添加量为900 mg/kg。     

仿刺参稚参“脱板病”超微病理的研究

利用电镜负染技术对2006年夏季大连地区养殖场患脱板病的仿刺参Apostichopus japonicus稚参组织匀浆液进行了检测。结果发现,提取液中存在大量病毒样粒子,该病毒粒子近似球形,具有囊膜。应用超薄切片电镜技术对患病刺参的超微病理进行研究,并与正常组进行了对照观察,结果发现:在病变细胞内存在大量直径80¹00 nm的具有囊膜的球形病毒样粒子,该病毒粒子以团聚或散落形式存在于细胞质内,并由质膜包被;病变细胞内内质网肿胀,部分核糖体脱落,其周围散落着大量明显呈六边形的病毒核心结构,并出现大量溶酶体残余体形成的髓袢样结构;高尔基体明显肿胀、膨大,线粒体界限模糊,出现嵴脱落;在病变严重的细胞内,可见细胞器崩解后形成的大量空泡结构。但未发现细菌和其他类可疑病原。     

几种中草药对刺参幼参的急性毒性试验

为探究刺参Apostichopus japonicus对中草药的毒性反应,在水温13~15℃下采用水生生物急性毒性试验方法对体质量为(2.36±0.41)g的刺参幼参进行了5种中草药急性毒性试验。结果表明:单方中草药对刺参幼参的毒性大小依次为五倍子>乌梅>石榴皮>黄芩>甘草;五倍子、乌梅、石榴皮、黄芩和甘草对刺参幼参的48 h半致死浓度分别为0.340、2.027、2.149、2.234、4.900 g/L,安全浓度分别为0.055、0.272、0.166、0.271、0.605 g/L;6组复方药物中毒性最大的是五倍子+甘草,其次是五倍子+黄芩、甘草+黄芩、石榴皮+五倍子,乌梅+石榴皮、五倍子+乌梅两组复方的毒性最低。研究表明,在安全浓度范围内,单方中草药五倍子、乌梅,复方五倍子+乌梅、石榴皮+乌梅可用作刺参细菌性疾病的防治药物。     

黄海北部仿刺参养殖池塘关键环境因子的周年变化与管理研究

研究了黄海北部非投喂型仿刺参Apostichopus japonicus养殖池塘的温度、溶氧、盐度、pH和大型生物等环境因子的周年变化特点,以及春季化冰期池塘的温度、盐度、pH的日变化规律,同时对池塘的纳潮换水、水位管理以及敌害生物的控制等技术环节进行了探讨,分析了环境因子与仿刺参养殖的关系。结果表明:(1)池塘周年水温变化在-1.2³0.4℃,最高在8月,最低在1月;溶解氧值波动于3.530.4℃,最高在8月,最低在1月;溶解氧值波动于3.5²1.3mg/L,冬季高,夏季低;溶解氧与温度之间的回归关系为DO=0.018T2-0.818T+15.805;pH值波动于7.6021.3mg/L,冬季高,夏季低;溶解氧与温度之间的回归关系为DO=0.018T2-0.818T+15.805;pH值波动于7.60⁸.72,冬、夏季高,春、秋季低;盐度波动于22.58.72,冬、夏季高,春、秋季低;盐度波动于22.5³3.5,夏季偏低。(2)冬季水温下降到-1.0℃时,池塘表层开始结冰并逐渐封冰;春季在化冰时存在温度和盐度跃层,可采用将表层水排放掉的方法消除跃层。(3)池塘的大型植物主要包括缘管浒苔、刚毛藻、沟草等,大型动物主要有矛尾鰕虎鱼、石鲽、花鲈、蓝点马鲛、鮻、斑鰶、鱵等鱼类,太平洋牡蛎、菲律宾蛤仔、黑荞麦蛤等贝类以及脊尾白虾、口虾蛄等。(4)在化冰期注意池塘盐度变化,化冰前池塘冰下水位应控制在12033.5,夏季偏低。(2)冬季水温下降到-1.0℃时,池塘表层开始结冰并逐渐封冰;春季在化冰时存在温度和盐度跃层,可采用将表层水排放掉的方法消除跃层。(3)池塘的大型植物主要包括缘管浒苔、刚毛藻、沟草等,大型动物主要有矛尾鰕虎鱼、石鲽、花鲈、蓝点马鲛、鮻、斑鰶、鱵等鱼类,太平洋牡蛎、菲律宾蛤仔、黑荞麦蛤等贝类以及脊尾白虾、口虾蛄等。(4)在化冰期注意池塘盐度变化,化冰前池塘冰下水位应控制在120¹30 cm以上,化冰后池塘水深应控制在150130 cm以上,化冰后池塘水深应控制在150¹70 cm以上。(5)在夏季高温期应注意监测溶解氧的变化,防止因藻类死亡腐败、溶解氧含量下降而导致仿刺参发生缺氧死亡的现象。     

仿刺参摄食砂砾粒度的选择性研究

在对自然海区和池塘养殖的仿刺参消化道内含物中砂砾粒度调查的基础上,选择不同粒度的砂砾作为试验材料,对苗种培育阶段不同规格仿刺参的摄食行为进行了研究。结果表明:仿刺参对摄食的砂砾粒度的选择性十分显著,自然海区仿刺参依生存环境的差异,其消化道内砂砾粒度组成比例略有差异,但其60%粒度组成区间为0.0625⁰.5 mm;池塘养殖仿刺参消化道内砂砾粒度组成60%粒度区间为<0.25mm;室内试验中,在各粒级砂砾比例相同的条件下各试验组仿刺参均表现出一致的粒度选择性,在其选择的砂砾颗粒粒度中,60%以上的颗粒粒径为0.1250.5 mm;池塘养殖仿刺参消化道内砂砾粒度组成60%粒度区间为<0.25mm;室内试验中,在各粒级砂砾比例相同的条件下各试验组仿刺参均表现出一致的粒度选择性,在其选择的砂砾颗粒粒度中,60%以上的颗粒粒径为0.125⁰.5 mm。因此可认为仿刺参摄食砂砾粒度的选择范围为0.1250.5 mm。因此可认为仿刺参摄食砂砾粒度的选择范围为0.125⁰.25 mm。     

用改良的TRIZOL法快速提取仿刺参和中间球海胆的总RNA

用改良的TRIZOL法和普通TRIZOL法分别提取仿刺参Apostichopus japonica体壁、肠、体腔液和中间球海胆Strongylocentrotus intermedius的管足、性腺、齿间肌的总RNA。结果表明:用普通TRIZOL法提取时间长,电泳条带不很清晰,存在降解且各个组织提取的状况不稳定,杂质量多;而用改良TRIZOL法能够快速提取仿刺参、海胆组织的总RNA,电泳后得到的28S rRNA和18S rRNA条带清晰、完整性好、纯度高、得率高,其A/A为2.04².14,总RNA浓度为44.962.14,总RNA浓度为44.96¹15.02 ng/μL。