常见食源性致病菌胞外代谢轮廓分析

寻找常见食源性致病菌间特征性代谢产物,是研发食品安全快速高效监控技术的基础。本文直接利用常见食源性致病菌发酵液冻干,经硅烷化试剂衍生,并采用气相色谱-质谱技术(GC-MS)对代谢产物进行分析,同时进行NIST11谱图库检索并分类,并对数据进行热图和主成分(PCA)分析。研究发现,发酵液中有大量有机酸、醇类和胺类等物质产生,且菌种间各代谢产物种类和相对含量差异显著;同时各菌间含有丰富的特有代谢产物,其中部分特有代谢产物在其他菌株中未见报道。通过热图和PCA分析各菌株胞外代谢轮廓可知,24 h时各菌株间能够明显区分,同时去除糖类和氨基酸后,PCA区分鉴定效果明显提高,尤其在24 h时最好。研究表明,胞外代谢轮廓分析可以用于寻找常见食源性致病菌生物标志物和菌种区分鉴定,同时部分菌种间特有的代谢产物有望成为常见食源性致病菌潜在生物标志物。     

添加ATP和生物素优化ε-聚赖氨酸发酵的研究

以白色链霉菌（Streptomyces albulus）突变株为研究对象,研究不同发酵时间在发酵培养基中添加ATP、生物素对ε-聚赖氨酸产量的影响。结果表明,在发酵36h时添加2mmol/L的ATP的产量比对照组提高了21.88%,达到1.17g/L;在0h、36h添加400μg/L生物素的ε-PL产量分别比对照组提升了30.88%和18.52%;通过进一步正交试验发现,在36h时添加300μg//L的生物素以及2mmol/L的ATP对该白色链霉菌ε-PL产量提升最大,比对照组提高了34.04%,产量达到1.193g/L,说明外源添加ATP和生物素对白色链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸有促进作用。     

饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌检测国标方法的改进

针对饮用天然矿泉水中产气英膜梭菌（Clostridiumperfringens）检测国家标准方法中,滤膜上的菌落在亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂经24h厌氧环境培养后黑色产生不明显的问题,对检验方法进行改进。国标改进方法一：按GB／T8538．4．55—2008进行过滤后增加一步骤,即用SPS培养基（约10mL）倾注于培养皿的膜上,然后放置厌氧培养;国标改进方法二：按GB／T8538．4．55—2008进行过滤后将滤膜反贴于SPS培养基上,然后放置厌氧培养。对方法进行改进后,国标改进方法一和国标改进方法二滤膜上的菌落经24h厌氧环境培养后均有明显的黑色产生。国标方法黑色菌落不明显,国标改进方法一和国标改进方法二产生的黑色菌落数与国标方法相比,具有显著性差异（P〈0．01）.国标改进方法一不但有利于产气荚膜梭菌黑色的产生,而且容易挑取菌落做进一步试验。     

基于环介导等温扩增技术的产呕吐毒素 蜡样芽胞杆菌特异性检测

本研究旨在建立食品中产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的快速检测方法。基于产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌合成酶基因cesB靶基因,设计4条特异性引物(2条内引物、2条外引物),建立环介导等温扩增技术(LAMP)。然后采用2株产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌、19株蜡样芽胞杆菌和41株非蜡样芽胞杆菌验证了该LAMP具有很好的特异性。LAMP检测的灵敏度在DNA水平上达到1.49 pg/μL,纯菌的灵敏度为5×10~3 cfu/mL。人工污染米饭样品,当起始污染量为2 cfu/g时,37℃增菌培养6 h,用试剂盒法和煮沸法提取的DNA,都可以检出产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌。采用此LAMP方法进行了72份实际样品的检测,检出2份产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌阳性样品,与传统方法一致。因此,本研究建立的LAMP检测方法可应用于食品中产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的快速特异检测。     

商品化复合型与自配LG培养基对保障生产线无菌验证效果的对比分析

比较3批商品化复合型LG培养基（简称：复合型LG）与由3个饮料生产厂自行采购原料配制的LG培养基（简称：自配LG）的感官指标、pH及生物学指标,从而评价复合型LG与自配LG培养基的稳定性,以及对无菌冷灌装生产线验证效果的影响。结果表明：在感官方面,3批复合型LG一致,3个自配LG培养基感官参差不齐,有的存在沉淀或杂质现象,不符合LG培养基的外观标准。在pH方面,3批复合型LG培养基pH一致,均在标准要求范围（6.5±0.2）内,pH使用前无需调试可直接使用,优于三个自配LG的培养基。在生长速度方面,复合型LG 3批效果相当,均优于3个自配,第7 d时,8个测试菌在3批次复合型LG上生长均已达最大值,而自配G和自配H分别接种黑曲霉和洋葱假单胞菌的管未见生长。结论：复合型LG培养基总体性能佳,批间稳定性很好,非常适合无菌冷灌装生产线的无菌验证。自配LG培养基批间稳定性差,检测灵敏度较低,存在低浓度微生物漏检的风险。     

显色底物磷脂酰肌醇的酶法制备及应用效果研究

磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)可以作为特异性底物对单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)进行快速检测。传统的PI分离方法效率不高,难以得到单一磷脂。而利用磷脂酶D(phospholipase D)的磷脂转移特性,水解大豆磷脂中除PI以外的成分,可以得到高纯度PI。通过单因素和正交试验设计,优化phospholipase D水解大豆磷脂的条件。实验结果表明,在100 mg大豆粉末磷脂中加入phospholipase D(≥50,000 units/mL)2.0μL,在37℃下反应4 h得到纯度达到86.67%的PI。进一步将制备产物用于显色培养基,经细菌试验显示了对LM具有特异的显色效果,可以作为昂贵的进口底物的替代品应用。     

大肠菌群特异性检测荧光底物MUGal的合成及应用

4-甲基伞形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷(MUGal)是食品安全中重要指示菌大肠菌群的特异性快速检测荧光底物。本文采用相转移催化方法使4-甲基伞形酮(4-MU)和四乙酰基-α-D-吡喃溴代半乳糖缩合生成保护的糖苷,再在碳酸钠的水/甲醇溶液中去保护生成4-甲基伞形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷。通过对温度、时间和催化剂用量对糖苷化一步产率的研究发现,当温度为30℃,反应时间为16 h时,产率最高可达73.12%。醇解反应一步以碳酸钠为碱产率可达91.01%。在对产物进行IR和1HNMR结构表征后,进一步将产物应用于大肠菌群显色培养基,并和进口底物比较,其产荧光管数经X2检验无显著性差异(P0.05),在实际样品检测中,采用GB4789.3-2010(48 h)和MUGal方法(24 h)的阳性检出率均为80%,MUGal方法的检出时间明显缩短。因此,本研究制备的荧光底物能和进口产品相媲美,可以作为进口底物的替代品。     

肉类及蔬菜食品中EHEC O157污染分布及分型研究

为深入了解肉类及蔬菜中肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC O157)的污染分布规律和遗传多样性,随机采集全国18个城市的食品样品,参考GB/T 4789.36-2008方法进行样品处理,并用rfbE/fliCH7双重PCR对菌株进行鉴定;分别采用单重PCR和ERIC-PCR对菌株进行毒力基因(eae、hlyA、stx1和stx2)检测和分子分型。结果表明,414份样品中检出18份EHEC O157阳性样品,总污染率4.35%,其中生鲜肉12份,速冻肉6份,蔬菜未检出;经过生化、血清鉴定和双重PCR检测,鉴定出52株EHEC O157,包括29株O157:H7,3株O157:NM(fliCH7+,无动力),2株O157:NM(fliCH7-,无动力)和18株O157:hund(未确定H型);毒力基因检测结果发现,52株菌株中有50株携带毒力基因,其中40株(76.92%)携带eae,31株(59.62%)携带hlyA,20株(38.46%)携带stx1,24株(46.15%)携带stx2。ERIC-PCR分型结果表明,在相似系数为0.80时,菌株可分为12个聚类簇,F型为其主要基因簇,分离株的基因型呈现多样性。     

珠江三角洲地区副溶血性弧菌遗传多样性和致病性相关研究

副溶血性弧菌(Vibiro parahaemolyticus)是一种常见的食源性致病菌,本文研究了珠江三角洲地区副溶血性弧菌的遗传多样性。从54株副溶血性弧菌出发,研究了它们的API20E生化反应、抗生素耐药性、O抗原血清型,进行了ERIC-PCR分子分型,并检测了两种毒力基因tdh和trh的分布。54株副溶血性弧菌可被分为6个生化反应类群,主要类群为Biochem-A;菌株对萘啶酮酸、环丙沙星、氯霉素均不耐药,而对氨苄青霉素耐药率最高,耐药率0.88;O抗原血清型分别为O1、O2、O3、O4、O5、O6、O8、O10、O11,O2为主要血清型,O3为临床主要血清型;ERIC-PCR分子分型将54株菌分成47个型别,ERIC-PCR图谱相似性大于0.80的类群有12个,没有明显的优势类群;有12株副溶血性弧菌为tdh阳性,阳性率为0.22,其中10株为临床来源菌株;有2株副溶血性弧菌为trh阳性,阳性率为0.04,均为食品分离株。珠三角地区食品和临床来源的副溶血性弧菌具有丰富的遗传多样性。     

食源性诺如病毒单克隆抗体可变区基因克隆及结构特征分析

食源性诺如病毒是引发全球食品安全事件的重要病原,近年来新冠疫情的持续肆虐,更突显了加强食品领域病毒安全研究的紧迫性。该研究以实验室前期获得的食源性诺如病毒高效单克隆抗体为对象,克隆并系统分析了其重链和轻链可变区基因序列。从分泌食源性诺如病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E3中提取总RNA,通过RT-PCR扩增单克隆抗体1E3的重链可变区VH和轻链可变区VL的DNA序列。将产物克隆到PMD19-T载体,测序并分析其可变区氨基酸序列。通过NCBIblast比对,显示扩增的VH和VL序列为小鼠抗体可变区序列,进一步利用Vbase2数据库对测序结果进行基因结构分析,定位了VH和VL上的高变区域互补决定区CDR和骨架区域FR,各包含3个CDR和4个FR区域,其中VH片段为360bp,编码120个氨基酸,属于IGHV3-2*02家族;VL片段为339bp,编码113个氨基酸,属于IGKV1-135*01家族。通过分子对接表明抗体重链上位点D108与病毒衣壳P蛋白上N195形成氢键,为关键氨基酸残基。食源性诺如病毒单克隆抗体VH和VL片段的成功扩增促进了基因工程抗体的发展及其在食品安全新型检测与控制技术的应用。