双启动子双报告基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞内进行表达。方法分别以pEGFP-N1和pDsRed-N1为模板,PCR扩增EGFP和DsRed基因,插入表达载体pCI中,分别构建重组表达质粒pCI-EGFP和pCI-DsRed,利用载体上BglⅡ和BamHⅠ为同尾酶的特点,将两个表达质粒酶切后拼接,构建双启动子双报告基因重组真核表达质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP,转染293T细胞,荧光显微镜观察EGFP和DsRed的表达,Western blot和流式细胞术检测EGFP和DsRed蛋白的表达。结果重组真核表达质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP经酶切鉴定和测序证实构建正确,两启动子为顺向相连;EGFP和DsRed蛋白在293T细胞中可同时正确表达。结论成功构建了双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞中表达,为实现两种外源基因在真核细胞内的同步表达及示踪提供了有效的分子工具。     

锌指蛋白转录抑制因子145′非翻译区内部核糖体进入位点的活性

目的检测锌指蛋白转录抑制因子14(positive regulatory domain zinc finger protein 14,PRDM14)5′非翻译区(5′untranslated region,5′UTR)内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)的活性。方法 PCR扩增PRDM14 5′UTR各截短序列的基因及全长基因,分别插入至双荧光素酶和红绿荧光报告基因中,构建重组质粒p RLPRDM14 S1-FL、p RL-PRDM14 S2-FL、p RL-PRDM14 S3-FL及p G-PRDM 14-R。将各重组质粒分别转染HEK293细胞,检测PRDM14 5′UTR IRES元件的活性、内部剪切位点和自身启动子的活性及影响IRES活性的序列。将重组质粒p RL-FL/5′UTR分别转染HCT-8/WT、Hep-2、Bel7402/WT和NIH3T3细胞,检测各细胞中PRDM14 5′UTR IRES元件的活性。结果 PRDM14 5′UTR具有内部核糖体进入位点元件活性;不具有内部剪切位点和自身启动子活性;PRDM14 5′UTR的活性激活中心位于25~60 nt,活性抑制中心位于60~95 nt;除NIH3T3细胞外,其他细胞均具有IRES活性。结论 PRDM14 5′UTR具有典型的IRES活性,为今后深入研究PRDM14表达的调控机制奠定了基础。     

重组人血清白蛋白-干扰素β融合蛋白的分离纯化及质控方法的建立

目的建立中试制备重组人血清白蛋白-干扰素β(Recombinant human serum albumin-interferonβ,rHSA-IFNβ)融合蛋白的纯化工艺及质控方法。方法采用50 L发酵罐诱导表达rHSA-IFNβ融合蛋白,发酵液经超滤浓缩及脱盐后,再经BlueSepharose FF亲和层析、G25凝胶过滤层析和SP Sepharose FF阳离子交换层析纯化。SDS-PAGE(银染法)和HPLC测定融合蛋白纯度,Western blot分析反应原性,质谱法测定相对分子质量,Edman降解法测定N-末端氨基酸序列,等电聚焦电泳法测定等电点,细胞病变抑制法测定rHSA-IFNβ融合蛋白的生物学活性,其余检测项目均按《中国药典》三部(2010版)要求进行。结果纯化的3批融合蛋白纯度可达96%以上,具有人血清白蛋白和人干扰素β的双重反应原性,相对分子质量分别为89 070、89 035和88 669,N-末端氨基酸序列为:NH2-D-A-H-K-S,等电点为6.34,比活性分别为1.9×106、1.5×106和1.1×106IU/mg,其余各项指标均符合要求。结论已成功建立了中试制备rHSA-IFNβ融合蛋白的纯化工艺及质控方法。     

非线性间歇过程的迭代学习状态估计

在间歇过程的状态估计中,如何充分利用多批次重复特性信息是一个挑战。迭代学习卡尔曼滤波方法利用卡尔曼滤波沿时间方向估计相邻两批次之间的状态误差,并沿批次方向迭代更新当前状态估计,兼顾了时间和批次两维特性。但是,这种方法只适用于线性系统。针对非线性间歇过程,提出一种迭代学习拟线性卡尔曼滤波器(ILQKF)方法。ILQKF基于间歇过程的标称模型,将实际状态与标称状态之间的误差作为新状态,建立了与误差相关的线性化模型。然后,根据迭代学习卡尔曼滤波方法,对状态误差进行估计,而状态轨迹为误差轨迹与标称轨迹之和,从而估计出非线性间歇过程的状态。啤酒发酵过程的应用仿真验证了ILQKF方法的优越性。     

红曲色素行业发展的问题与分析

红曲色素是我国特有的一种传统发酵产品,它主要用于食品工业的着色剂,然而在红曲色素产业中存在众多问题,如桔霉素、微生物残留、产品单一应用范围窄等问题,这些问题在一定程度上限制了红曲色素产业的发展。对红曲色素产业中存在的上述问题进行分析,并对红曲色素产业进行展望,探讨红曲色素产业发展策略。     

出口加工区卡口控制管理系统设计与应用

本文介绍了适用于某出口加工区的卡口控制管理系统。该系统分为前台通道控制和后台管理两大模块。前台通道控制主要完成对集装箱号识别、电子车牌、数据查验比对和通道外围设备控制功能。后台管理主要负责人员IC卡、客运车辆和集装箱电子车牌管理以及进出口信息查询和报表打印等功能。本文对整个卡口控制管理系统的设计和实现作了详细的描述。     

接触印刷过程中纸张油墨结合效应的研究

接触印刷分为2个不同的阶段:压印过程和自由渗透过程。采用渗流理论优化了接触印刷加压过程中油墨的渗透深度,避免了Olsson方程对毛细管半径的简化。自由渗透阶段,考虑到了动态接触角随动态接触线速度变化的因素,采用了动态润湿方程使得油墨的自由渗透深度计算更为准确,最后采用分形理论完成了毛细管半径的计算,进而完成了油墨渗透深度的研究。     

重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD的构建及其对胃癌细胞的杀伤作用

目的构建重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD,并探讨其对胃癌细胞的杀伤作用及可能的机制。方法利用同源重组的方法在痘苗病毒VG9的TK区插入锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn SOD)基因,构建重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD,经筛选及纯化后,测定病毒滴度。将重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD及痘苗病毒VG9分别按不同的MOI(0.01、0.1、1、10)及转染时间(12、24、36、48 h)转染至人胃癌细胞株7901,MTT法检测病毒对胃癌细胞的杀伤作用。按MOI=1将重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD及VG9分别转染人胃癌细胞株7901 48 h,同时以PBS作为对照,Western blot法检测胃癌细胞中Mn SOD的表达,流式细胞术检测胃癌细胞的凋亡情况。结果经筛选及纯化后,重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD滴度为2×108 pfu/m L。MOI为1和10时,重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD对胃癌细胞的杀伤作用明显优于VG9(P0.05);转染24和36 h,重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD对胃癌细胞的杀伤效果明显强于VG9(P0.05)。转染后,Mn SOD蛋白可在胃癌细胞中呈高表达,且VG9-Mn SOD组胃癌细胞的凋亡率明显高于VG9组及对照组(P0.05)。结论成功构建了重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD,其对胃癌细胞具有明显的杀伤作用,该作用可能是通过促进胃癌细胞凋亡产生的。