易错PCR定向进化技术提高蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR-10核酸酶活性的研究

以分子伴侣skp修饰的蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR-10(A stragalus membranaceus pathogenesis-related protein-10)全基因为模板,通过易错PCR定向进化技术构建突变体文库,以酵母tRNA为底物建立高通量筛选方法,获得了核酸酶活性提高的AmPR-10突变体.经一轮定向进化后,突变体A4的核酸酶活性比野生型提高45％;测序结果显示,突变体A4基因序列在465位增加了1个碱基A,进而由移码突变引起了多肽序列的提前终止,使得突变体A4 C末端缺失了3个氨基酸;从空间上看,AmPR-10基因的突变减小了其C末端α螺旋对空腔的遮蔽作用,有利于目的蛋白与配体或底物的结合.该研究结果对AmPR-10核酸酶活性机制的探讨具有重要意义,为抗病抗逆黄芪植株的培育奠定了理论基础.     

酶定向进化技术及其在化学品生物转化中的应用

定向进化可有目的地按照需要改造蛋白质分子中的氨基酸残基或结构域,从而定向改造蛋白质的性质,使其成为具有人们预期功能的新型蛋白质,应用于不同化学品生物转化反应中。本文简要的介绍了酶定向进化技术及其在化学品生物转化中的应用。     

通过定向进化策略提高酯酶立体选择性的研究

对菌株Rhodobacter sphaeroides的RSP-2728酯酶基因进行立体选择性定向进化研究,建立了有效的定向进化策略,以及通过扁桃酸甲酯水解反应所产生的酸根离子浓度来监测酶活的高通量筛选方法.利用易错PCR技术,进行了三轮突变,获得了突变株A6A5,B7F11和C8G1,对映体选择性(E值)从3.13分别...     

米曲霉β -半乳糖苷酶的定向进化、高效表达及应用

定向进化米曲霉β-半乳糖苷酶（AoBgal35A）,以提高其水解乳糖的效率,通过易错PCR构建米曲霉β-半乳糖苷酶的突变体文库,高通量筛选水解乳糖效率高的突变体,将其在毕赤酵母中高效表达,并用于制备无乳糖牛奶。筛选得到一个正向突变体（mAoBgal35A）,经高密度发酵酶活力达4 760 U/mL。纯化后,mAoBgal35A的最适pH和温度分别为5.0和55 ℃,比野生型AoBgal35A分别提高了0.5和降低了5 ℃。mAoBgal35A在室温下能高效水解牛奶中的乳糖,加酶量为2 U/mL时,水解72 h后牛奶中的乳糖质量浓度为0.38 g/dL,达到无乳糖牛奶标准。而野生型AoBgal35A的加酶量为20 U/mL时,在相同条件下水解后,乳糖质量浓度为0.6 g/dL。由此表明,定向进化明显提高了米曲霉β-半乳糖苷酶水解乳糖的效率,所得正向突变体在制备无乳糖乳品中具有很大的应用潜力。     

β-琼胶酶AgaB催化活性的定向进化

用体外定向进化技术提高了β-琼胶酶AgaB热稳定突变酶M446的催化活性。采用易错PCR和化学诱变法相结合的方法,构建了M446的突变体文库;利用琼胶酶降解琼胶在平板上产生水解圈的特性,建立了阳性克隆的高通量筛选体系。最终筛选得到酶活性得到提高且保持较高耐热性的突变酶M117,其酶活提高为突变酶M446的3倍。测序分析发现编码突变酶M117的DNA序列中有4处点突变,其中2处为同义突变,另外2处引发氨基酸替换,分别为R9K和1111V。对突变酶M117与M446的动力学常数进行了比较,发现M117的Km值降低了93.4％,Kcat／Km值提高了15倍,由此可以推断突变酶M117比活力提高的主要原因是酶与底物的亲和能力提高。     

抗菌肽DCD-1L的随机突变及在毕赤酵母中的表达

目的用毕赤酵母构建抗菌肽DCD-1L的随机多肽库,并使随机多肽在培养基中表达。方法用定向进化的方法在基因内部造成随机突变,然后将其构建到含有强启动子GAP和α-factor信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体pGAPZαC中,线性化后转化到巴斯德毕赤酵母蛋白酶缺陷株SMD1168中,形成突变库。利用抗生素Zeocin筛选出阳性克隆,并用SDS-PAGE鉴定表达蛋白质。结果肽库库容达到7．8×10^3个cfu,在上清中鉴定出了表达蛋白。结论成功构建了抗菌肽DCD-1L的随机多肽库,并实现了在培养基上清中的表达。     

易错PCR技术提高嗜热酸性III型普鲁兰水解酶TK-PUL催化活性的研究

嗜热酸性III型普鲁兰水解酶TK-PUL在液化条件下可完全水解淀粉为淀粉糖,在“液化糖化一步法”的淀粉制糖工艺中具有巨大的应用潜力。本研究拟采用易错聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术提高TK-PUL的催化活性。经过两轮易错PCR及高通量筛选,获得了催化活性提高的突变体L538D。与TK-PUL相比,L538D以可溶性淀粉为底物的比酶活力提高了50%,以普鲁兰多糖为底物的比酶活力提高了21%;L538D以可溶性淀粉、普鲁兰多糖为底物的k_cat/K_m值分别提高了44%、27%。即L538D的α-1,4-糖苷键水解活性和α-1,6-糖苷键水解活性均明显提高,并且其α-1,4-糖苷键水解活性的提高幅度更大。同源模建得到的蛋白质分子结构显示,将TK-PUL中Leu538替换为Asp,可能通过缩短氨基酸残基侧链的长度和减弱氨基酸残基的疏水性,提高了催化活性位点Glu538所在loop结构的柔性,从而提高酶的催化活性。本研究结果表明,TK-PUL中Leu538是影响其催化活性的重要氨基酸残基。     

嗜热杜邦菌α-淀粉酶的定向进化及高效表达

目的:对嗜热杜邦菌来源α-淀粉酶进行分子改造,以提高其耐热性和产酶水平。方法:基于易错PCR技术构建嗜热杜邦菌来源α-淀粉酶（Td-amy）的随机突变文库,高通量筛选耐热性和比酶活提高的突变体,通过定点突变及同源结构模拟对突变体进行分析,并将其在毕赤酵母中表达。结果:筛选得到一个正向突变体（mTd-amy）。该突变体最适温度（60 ℃）较野生型（55 ℃）提高了5 ℃,比酶活（466.3 U/mg）较野生型（227.9 U/mg）提高至2.0倍。经序列对比,mTd-amy有四个氨基酸发生了变化,分别为Ala4Val、Ala122Val、Lys194Arg和Ala468Asp,定点突变结果表明Ala122Val和Ala468Asp位点为影响其比酶活和最适反应温度的关键。进一步将突变体mTd-amy在毕赤酵母中高效表达,经高密度发酵其酶活达64696 U/mL。结论:定向进化获得了嗜热杜邦菌来源α-淀粉酶的正向突变体,该突变体的最适温度和比酶活力均明显提高,为α-淀粉酶的分子改造以及工业化应用等提供了理论参考。     

建立高通量筛选耐热胆固醇氧化酶的方法

建立了一种以滤膜为基础的高通量筛选耐高温胆固醇氧化酶产生菌的方法.利用酶偶联及胆固醇不溶于水的特性产生显色透明圈.酶的热处理过程和酶与底物的反应过程分开,有效地防止酶在热处理前与底物反应.高温处理是在滤膜上进行,从而克服了高温琼脂平板变软或熔化的缺点.用该方法筛选时,产生的红褐色透明圈较明显,易于挑出性能改善的突变菌株...     

酶法脱酸的研究进展与发展展望

酶法脱酸具有反应条件温和、催化特异性高及环保等优点，是未来油脂脱酸领域的主要发展方向。对酶法脱酸近30年来的研究进展进行了归纳和总结，特别是对近年来新型酶法脱酸技术、新颖酶及新型酶制剂在酶法脱酸中的应用进行了归纳和总结；并针对限制酶法脱酸工业应用的问题，提出了可行的解决策略；最后，对油脂酶法脱酸的发展作出了展望。