易错PCR技术改造β-环糊精葡萄糖基转移酶的催化特性

β-环糊精是一种环状多糖,可用于改变某些大分子化合物的理化性质,在食品、生物及医药等领域都具有很高的工业应用前景。通过利用β-环糊精葡萄糖基转移酶（β-CGTase）,使其作用于淀粉等含有葡萄糖基的多糖化合物,可转化生成β-环糊精。该研究采用易错PCR技术对来源于Paenibacillus campinasensis的β-CGTase进行定向进化,得到酶活力高的突变体,并对突变体进行镍柱亲和纯化与酶学性质分析。实验最终获得了一株突变体Q280L,其酶活力与原始-CGTase相比提高了42.10%,对β-环糊精的转化率提高了7.60%,最适反应pH值和稳定性均有所变化,底物亲和力提高46.13%。经序列比对及结构分析,发现突变体Q280L与野生β-CGTase相比,第280位氨基酸残基种类以及周围氢键发生变化。该试验结果表明,基于易错PCR技术对β-CGTase基因进行定向进化,可提高酶活力和改善酶学性质,为实现β-环糊精的工业生产提供参考意义。     

米黑根毛霉甘露聚糖酶的定向进化、高效表达与应用

为提高米黑根毛霉甘露聚糖酶（RmMan5A）对魔芋粉的水解效率,利用定向进化技术对该酶进行分子改造,经两轮筛选获得了一个对甘露聚糖酶催化效率显著提升的突变体（RmMan5AM2）。该突变体的最适pH为7.0,最适温度为65 ℃,较野生型甘露聚糖酶提高了10 ℃。该突变体继承了野生型甘露聚糖酶的高比酶活力,对槐豆胶的比酶活力达10 371.4 U/mg。在最适条件下,该突变体对槐豆胶、魔芋粉和瓜尔胶的催化效率分别提高了37.4%、28.9%和34.4%。进一步将该突变体在毕赤酵母中进行高效表达,经过156 h高密度发酵,发酵液胞外酶活力达176 000 U/mL,是目前产甘露聚糖酶的最高水平。利用该突变体水解魔芋粉成功制备魔芋甘露寡糖,产物主要为聚合度2~6的甘露寡糖（相对峰面积>85%）,总得率为88.5%。该突变体具有优良的酶学性质,对魔芋粉的水解效率显著提升,在魔芋甘露寡糖的酶法制备中具有很大的应用潜力。     

生物转化技术的前景

生物技术快速发展，已经成为合成新药最重要的途径之一。2010年，约20％的化工产品将由生物技术工艺生产，其销售价值将达到3100亿美元。生物技术工艺应用潜力最大的领域是精细化学品，预计2010年其销售值的60％将来自于生物技术。     

酶活性设计的新方法——半理性设计

许多研究小组利用整基因随机突变形成和重组方法,已成功的进行了酶的定向进化。酶工程的最新进展就是使这些定向进化的方法相结合,并与理性酶修饰方法的要素随机结合,通过各种组合选择出适合的方法来避免定向进化和理性设计的限制。半理性方法是以多个特定的残基为靶标在结构或功能知识的基础上突变构建简洁库,它更有希望得到正确的结果。突变体的高效抽样可能对酶功能有影响,随着底物选择性和特异性的提高,及其在已知的结构中经过重新设计使酶活性有了显著提高,这种高效抽样可被引入实验,当规模较大时它会被引入计算机方法。     

米黑根毛霉α-淀粉酶的定向进化、高效表达及在面包中的应用

本研究利用定向进化技术对米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)来源的α-淀粉酶(RmAmy)进行分子改造、高效表达突变酶及其在面包中的应用。突变酶(mRmAmy)的最适pH和温度分别为5.0和65 ℃,比野生型下降1.0 pH和10 ℃；该酶在pH 4.0-10.0和60 ℃以下稳定。mRmAmy经高密度发酵168 h,酶活力最高达11900 U/mL。mRmAmy应用于面包制作中,在加酶量为3 ppm时,面包比容增加14.4%,硬度减小25.8%。结果表明mRmAmy在烘焙工业中具有很大的应用潜力。     

《应用生物催化》特色教学内容概览

《应用生物催化》是生物化工专业的核心课程。其研究为化学、医药、食品等领域高附加值产品的生产奠定基础。生物催化的特色教学领域包括非水相体系、手性物质合成、定向进化和极端微生物等方面。应用生物催化核心教学内容的归纳与总结,将有助于学生快速掌握本学科的知识体系,并为生物化工领域的科研人员提供重要参考资料。     

应用全合成噬菌体抗体展示库技术实现抗膀胱癌单链抗体的定向进化

单链抗体在肿瘤治疗的临床应用中常会遇到两方面的问题，即低亲和力和鼠源性导致的免疫原性。为此，我们对鼠源抗膀胱癌单链抗体进行人源化改造，并从噬菌体抗体库中筛选具有高亲和力的人源化的单链抗体分子。运用噬菌体展示技术，成功构建了库容为10^6人源化的噬菌体抗体库，用膀胱癌细胞系膜抗原进行三轮筛选，得到了2个结合抗原活性高于起始的鼠源单链抗体的人源化抗膀胱癌单链抗体。     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因定向进化研究

为得到具有催化活性的重组亚油酸异构酶,对嗜酸乳杆菌AS1.1854菌株亚油酸异构酶基因进行体外定向进化.经过两轮连续易错PCR扩增及一轮DNA改组获得了突变基因片段,并克隆到pET30a质粒载体上,转化大肠杆菌,构建了该酶的基因突变文库.经IPTG诱导表达后筛选出一株重组菌,可表达可溶性重组酶蛋白,经紫外分光光度计法测定,重组酶蛋白活力为8.2 U.     

分子生物学技术在纤维素酶改造中的应用

纤维素是地球上数量最大的可再生资源,利用纤维素酶将其转化为人类急需的能源、食物和化工原料,对于人类社会解决能源危机、食物短缺和环境污染具有重大的现实意义.作者介绍了纤维素酶分子特性及作用机理,综述了近年来基因克隆、理性设计和定向进化等分子生物学技术在纤维素酶改造方面的研究进展.     

易错PCR技术定向进化褐藻胶裂解酶Alg-2的分析

为提高褐藻胶裂解酶活力,采用易错聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术对海洋细菌Tamlana sp. S12中具有代表性的酶组分Alg-2进行体外定向进化。经过2?轮易错PCR及96?孔板发酵筛选,分别获得2?株正突变和2?株负突变菌株,其酶比活力分别是亲本（2?675.2?U/g）的162%、241%、53%、11%。酶的动力学分析显示,正突变株P2-81的Km值比亲本降低50%,而负突变株N2-47的Km值比亲本提高106%,表明突变株对底物的亲和力有极大的上升和下降。基因测序及氨基酸序列分析结果表明,Glu、Thr、Ser、Asp和Tyr对褐藻胶裂解酶活力提高起到正面的积极作用,而Lys的突变起到负面的消极作用,后续人工合成的定点突变则进一步证实Asp和Lys的正/负作用。本研究有助于深入理解褐藻胶裂解酶的催化机制,为后续利用理性设计手段改造褐藻胶裂解酶提供理论参考。