红色红曲菌组蛋白去乙酰化酶MrSir2的原核表达及活性分析

根据基因组序列信息,利用cDNA末端快速扩增技术(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)得到了红色红曲菌中组蛋白去乙酰化酶mrsir2基因的完整cDNA序列,其编码序列(coding sequence,CDS)为1539 bp,编码512个氨基酸,含有一个SIR2蛋白保守结构域。根据大肠杆菌的密码子的偏好性对mrsir2序列进行优化,优化后的序列与p ET-28b载体连接后转入宿主菌E.coli BL21中进行IPTG诱导表达,并优化表达条件。实验结果表明:在16℃条件下用终浓度为0.25 mM的IPTG诱导培养16 h后,目的蛋白Mr Sir2可溶性表达效果良好。Ni2+柱亲和层析纯化后的Mr Sir2重组蛋白在SDS-PAGE上显示为一条约75 ku大小的条带,蛋白定量浓度达1.97 mg/mL,经Western blot鉴定为目的蛋白,测定酶活为78.5(OD/min/mg),780μM的二氢香豆素(dihydrocoumarin,DHC)对Mr Sir2蛋白的酶活抑制率为47%。Mr Sir2蛋白的可溶性表达为全面了解其酶学特征提供了材料,也为体外分析蛋白相互作用奠定了基础。     

水溶性红曲黄色素的制备

红曲红色素与连二亚硫酸钠在碱性溶液中反应,制得水溶性红色素。结构分析认为是红曲红色素分子中的内酯水解,同时引入磺酸基。对其性质实验结果表明,它的最大吸收波长是476nm,水溶性好,具备了食用色素的优良特性。     

红曲霉Monascus sanguineus X1处理黄水的培养基优化及酯化液制备

黄水是白酒酿造的主要副产物之一,富含多种有机质,可用于制备酯化液促进白酒增香,提高其利用率。研究了一株高产酯化酶的红曲霉菌株Monascus sanguineus X1,以酯化酶活力为指标,从碳源、碳氮比、接种量和pH值4个方面对X1菌株的培养基进行单因素实验及正交试验优化;采用酯化酶液处理黄水,制备酯化液,研究了黄水、乙醇、己酸等酯化前体物质添加量对酯化液制备的影响。结果表明,该红曲霉优化发酵培养基组分(以100 mL计):大米粉7.0 g,大豆蛋白胨2.0 g,NaNO30.2 g,KH2PO40.15 g,MgSO4·7H2O 0.1 g,培养基初始pH值5.0,接种量10%(体积分数)。在此条件下,添加体积分数为10%的黄水和体积分数为4%的乙醇,酶活力可达745.80 U/mL。向酯化酶液中加入体积分数为0.8%的己酸和体积分数为20%的乙醇继续培养1 d后,酯化液中己酸乙酯的体积分数可达0.121%;而向酯化酶液中补加体积分数为10%的黄水后,己酸乙酯和乳酸乙酯的体积分数分别可达0.055%和0.032%。该结果旨在为将黄水资源用于白酒增香提供理论参考。     

红曲发酵液中水溶性红曲黄色素的吸附分离

本文考察不同极性大孔树脂、离子交换树脂、活性炭及硅胶等吸附介质对红曲菌深层发酵液中水溶性红曲黄色素的吸附分离性能。结果显示非极性大孔树脂DA201-C效果最好,该吸附过程符合Freundlich方程,吸附动力学符合准一级动力学模型,表明吸附不受单层吸附的限制;液膜扩散是吸附主要限速步骤,扩散速率常数为0.16 min-1。通过静态和动态吸附洗脱条件优化,运用SPSS对数据进行分析,发现静态吸附、解吸料液比为1:2,吸附、解吸时间15 min,解吸液100%乙醇,酸性条件解吸效果较好;动态吸附解吸流速为0.25 BV/min条件下,可得到高回收率（96.99%）、脱盐率（99.44%）和脱糖率（92.52%）的水溶性红曲黄色素,经初步扩大实验显示吸附解吸性能稳定。大孔树脂DA201-C分离纯化发酵液中水溶性红曲黄色素操作简单、快速、放大性能好,具有很好的工业化生产应用价值。     

红曲霉菌胞外多糖的分离纯化、结构鉴定及抗氧化活性测定

目的:分离纯化红曲霉菌胞外多糖（Exopolysaccharide,EPS）,测定各组分的抗氧化活性并对其结构进行初步表征。方法:红曲霉菌发酵液经乙醇沉淀获得胞外多糖,经精制除杂和DEAE-纤维素柱层析法分离纯化获得多糖组分,再分别用高效凝胶过滤色谱法（HPGFC）、柱前衍生PMP-HPLC法测定相对分子质量（Mw）和单糖组成,测定多糖组分清除DPPH和羟自由基的能力,评价其体外抗氧化活性。结果:EPS经分离得到三个组分EPS-1、EPS-2和EPS-3,相对分子质量分别为8673、143537、238742 Da。EPS-1、EPS-2均由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖组成,摩尔比为1∶0.301∶2.052∶3.614和1∶2.475∶1.950∶1.532,EPS-3由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖组成,摩尔比为1∶0.401∶0.066∶0.307∶2.974。三个多糖组分对DPPH·和羟自由基均有清除能力,并与多糖浓度呈现正相关。当多糖浓度为1 mg/m L时,三个组分对DPPH清除率分别为16.4%、15.9%和14.8%;对清除羟自由基的清除率分别为40.4%、39.6%、63.8%。结论:红曲霉菌胞外多糖各组分的相对分子质量和单糖组成比例均有差异;对羟自由基、DPPH·的清除作用也存在差异,这种活性差异可能与各组分Mw及结构差异相关。      

红光对紫色红曲霉生长及色素和桔霉素产量的影响

本文研究了红光对紫色红曲霉M9生长及色素和桔霉素产量的影响。采用高效液相色谱法对六种红曲色素,包括两种红色素：红斑红曲胺（rubropunctamine,RUM）和红曲玉红胺（monascorubramine,MOM）;两种黄色素：红曲素（monascin,MS）和红曲黄素（ankaflavin,AK）;两种橙色素：红斑红曲素（rubropunctatin,RUN）和红曲玉红素（monascorubrin,MON）以及桔霉素的产量进行测定。结果表明：持续红光照射促进了紫色红曲霉M9菌丝生长、色素合成积累以及孢子形成,尤其对于闭囊壳的产生有更显著促进作用。5种不同的红光照射条件促进了RUM、MOM、MS和AK的产生,抑制了RUN、MON和桔霉素的产生。在光照强度300 lux,光照时间30 min/d,光照节律12 h的最佳光照条件下,RUM、MOM的产量分别提高了53.8%和75.2%;MS和AK的产量分别提高了42.2%和59.4%;RUN和MON的产量分别降低了42.6%和54.5%;桔霉素的产量降低了42.5%。     

红曲霉白色突变株固态发酵生产酸性蛋白酶的研究

红曲霉白色突变株因不产色素可扩大红曲霉的使用范围,对经紫外诱变后的红曲霉白色突变株(W1)进行固体发酵并对其所产生的酸性蛋白酶的性质进行初步研究.研究表明此酸性蛋白酶最适反应温度为50 ℃,在30～40 ℃下相对稳定;最适反应pH为3.0,在pH 3.0～5.0之间相对稳定;Mn2 、Ag 、K 对酸性蛋白酶有激活作用,Fe3 、Al3 、Mg2 、Cu2 对酸性蛋白酶有一定抑制作用.通过Sephadex-G75凝胶过滤层析及SDS-PAGE蛋白质电泳分析此蛋白酶的相对分子量范围大约在55000～60000之间.     

出芽短梗霉产色素能力弱化菌株的筛选

出芽短梗霉在发酵过程中会产生一种与黑色素相似的黑色物质 ,并且这种物质会牢固地粘附在短梗霉多糖上 .对出芽短梗霉Aureobasidium pullulanB 1菌株进行6 0 Co诱变 ,获得了一株产色素能力缺失型菌株Co3,其菌落和发酵液颜色为白色或淡绿色 .红外光谱和磁核共振图谱表明该菌株的产物与标准短梗霉多糖样品有相同的结构 .     

不同品种大米发酵紫色红曲霉产色素的特性分析

该研究以一株色素产量稳定的紫色红曲菌为试验菌株,采用不同品种的大米（粳米、籼米、糯米）作为基质进行液态摇瓶发酵,通过测定生物量、葡萄糖含量、大米成分,分析红曲霉生长状况,借助高效液相色谱、薄层色谱和色差仪对发酵所产红曲色素的颜色特性及安全性进行评价。结果表明：粳米发酵的胞外色价最高,于505 nm处最高可达19.07 U/mL,是籼米的2.28倍,糯米的2.53倍;发酵3~4 d籼米的红曲菌胞内色价可达947.46 U/g（505 nm）,分别是糯米的1.24倍和粳米的1.33倍;发酵6~7 d粳米的胞内色价较高,于505 nm处可达1762.80 U/g,分别是籼米的1.41倍和糯米的1.86倍,粳米的后期发酵更利于M9的色素累积。HPLC分析六种主要红曲色素产量表明,籼米和糯米发酵显著促进了两种橙色素O1、O2在胞内积累,发酵第7 d的产量分别是粳米的5.00倍和6.31倍,粳米发酵更有利于红色素（R1、R2）及黄色素（Y1、Y2）产生;三种大米相比,粳米发酵所产桔霉素最低,安全性更高。总体而言,以粳米为基质发酵更利于M9产红、黄色素,而糯米和籼米更利于红曲菌M9产橙色素。     

普鲁兰酶突变体文库高通量筛选方法的建立及应用

在摇瓶水平实现普鲁兰酶基因(Gen Bank Accession No:AX203843)在大肠杆菌BL21(DE3)的异源表达,并成功按规格缩小实现了基于深孔板的高通量细胞培养,同时建立了基于深孔板的普鲁兰酶酶活快速高效的高通量检测方法。利用易错PCR技术对普鲁兰酶基因进行定向进化,突变基因产物重组于表达载体p ET-28a(+)-pel B中,并导入大肠杆菌BL21(DE3)构建突变体文库,利用该高通量筛选方法实现了突变体文库的快速高效筛选并获得了一株突变菌株4A4,其表达量提高了46.5%。该方法不仅适用于淀粉酶、纤维素酶等酶类的高通量筛选,同时为菌株文库的筛选以及蛋白质的定向进化提供了一种新思路。