颗粒溶素活性肽与增强型绿色荧光蛋白融合基因真核表达质粒的构建及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的构建人颗粒溶素(GLS)活性肽(9ku-GLS)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因的真核表达载体,并检测其在小鼠黑色素瘤细胞B16中的表达。方法经PCR扩增9ku-GLS基因,插入质粒pBudCE4.1中,经酶切及测序鉴定正确后,亚克隆至质粒pEGFP-C1中,将融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K转染B16细胞,采用荧光显微镜及RT-PCR法检测融合蛋白的表达。结果融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K经双酶切鉴定证明构建正确,转染B16细胞24h后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,且经RT-PCR可扩增出267bp的目的基因片段。结论已成功构建9ku-GLS与EGFP融合基因的真核表达质粒,且在B16细胞中表达了融合蛋白。     

携带人6Ckine/IFNγ融合基因腺病毒载体的构建和鉴定

目的构建携带人次级淋巴组织趋化因子(6Ckine)和γ-干扰素(IFNγ)融合基因的重组腺病毒载体Ad-6Ckine/IFNγ,并在真核细胞中表达。方法RT-PCR法分别从人淋巴结和外周血单个核细胞中扩增人6Ckine cDNA和IFNγ cDNA,分两步先后将6Ckine cDNA和IFNγ cDNA连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,二者之间以XbaⅠ酶切位点相连,应用AdMax腺病毒包装系统在HEK293细胞内同源重组,构建重组腺病毒载体Ad-6Ckine/IFNγ,经扩增和纯化后感染真核细胞HepG2,并检测6Ckine/IFNγ融合蛋白的表达。结果所构建的重组腺病毒Ad-6Ckine/IFNγ经扩增和纯化后,滴度为1.26×1010IFU/ml。PCR法鉴定无野生型腺病毒的污染,所携带的6Ckine/IFNγ融合基因能在真核细胞中得到表达,表达形式为分泌型。结论已成功构建重组腺病毒载体Ad-6Ckine/IFNγ,并在真核细胞中表达,为进一步研究肿瘤的基因和免疫治疗奠定了基础。     

轮状病毒LLR疫苗株VP7基因的遗传变异研究

目的研究轮状病毒(RV)LLR疫苗株VP7基因的遗传特征,为疫苗的质量控制和发展提供依据。方法将LLR株轮状病毒毒种LLR38在原代牛肾细胞上连续传至49代。提取第38、43、44、49代病毒RNA。通过RT-PCR扩增VP7基因片段,将其克隆入质粒pGEM-T中,进行序列测定与分析。结果LLR株VP7基因全长1062bp,含编码326个氨基酸的单一的开放读码框架(ORF)。各代次病毒的VP7基因核苷酸与推导的氨基酸变化完全一致,与GenBanK中LLR参考株(L11602)同源性分别为99.9%和99.7%。与14株G10血清型RV毒株之间,核苷酸与推导的氨基酸序列同源性分别为84.3%～87.4%和92.7%～94.9%;与不同血清型RV代表株间,VP7基因核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为62.2%～76.8%和72.9%～83.1%;在A、B、C3个重要抗原表位,LLR株与同一血清型RV代表株B223氨基酸同源性高达97.5%,而与不同血清型仅为42.5%～62.5%。结论轮状病毒LLR疫苗株VP7基因具有良好的遗传稳定性,与来自不同国家同一型别的RV株VP7蛋白氨基酸序列之间无明显差异,在遗传上密切相关,从VP7基因分子水平证明LLR株毒种及其制备的疫苗是安全可靠的。     

共表达口蹄疫病毒O型P1-2A-IL-18基因和Asia I型P1-2A-3C基因重组鸡痘病毒的构建

目的构建共表达口蹄疫病毒(FWDV)O型P1-2A-IL-18基因和AsiaI型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒。方法将酶切得到的FWDVO型P1-2A-IL-18基因和AsiaI型P1-2A-3C基因克隆至鸡痘病毒表达载体pUTAL上,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-P1-2A-IL-18,与鸡痘病毒(FPV)282E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过BrdU3次加压筛选,挑选出单克隆重组病毒株,进行RT-PCR及间接免疫荧光(IFA)鉴定。结果重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-P1-2A-IL-18经双酶切鉴定证明构建正确。经RT-PCR和IFA鉴定,证明所筛选的重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-3C-P1-2A-IL-18基因盒。结论已成功构建了共表达FMDVO型P1-2A-IL-18基因和AsiaI型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒。     

人CD271基因的克隆及原核表达

目的克隆人CD271基因,并在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR技术从人REH细胞系中扩增CD271基因,将其克隆入pET22b表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行纯化及Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET22b/CD271经双酶切鉴定,可见1197bp的目的基因条带。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约75000处可见表达条带。IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白表达量最高。纯化后蛋白纯度为82.5%。Western blot检测表明纯化后的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆了人CD271基因,并在大肠杆菌中获得表达。     

石油生物脱硫的微生物学研究进展

原油硫含量的持续上升和环保法规的日益严格推动了石油生物脱硫的研究。本文介绍了过去几年国外在这方面的研究进展,突出了从脱硫菌种的微生物学和基因学等角度对石油生物脱硫过程及生物催化剂的性能改善的研究,并对生物脱硫技术的应用前景及存在的问题提出了看法。     

凋亡相关基因在增生性瘢痕组织中的表达与分布

目的 探讨凋亡相关基因在增生性瘢痕(HS)组织中的表述水平与分布特点.方法 对21倒不同时期的增生性疲痕夏5例正常皮肤分别进行Fas、p53、Bcl-2、Bax、 c-Mye免疫组织化学染色和原位凋亡染色.结果 在增生性瘢痕组织中,上皮基底层细胞及间质纤维细胞均有Fass表达,且纤维纽织越幼稚,表达越强;Bax主要在上皮基底细胞表达,且病变较陈旧的较强,较幼稚的纤维细胞也有表达Bcl-2在幼稚的纤维细胞有弱表达;c-Myc在间质纤维细胞有较强表达,有分层现象,与病变成熟程度相关.结论 在瘢痕修复过程中,纤维细胞增生与凋亡呈动态平衡过程,受多种基因精确调控,增生过度或凋亡减少均可导致增生性疲衰的形成.     

人内皮抑素基因对人脐静脉内皮细胞周期变化的影响

目的 研究人内皮抑素基因对人脐静脉内皮细胞增殖能力的影响.方法 RT-PCR获取人内皮抑素基因(hEndostain,hES),通过酶切、测序鉴定获取的hES,MTT法检测该基因对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响.结果 获得的hES基因经测序证实成功克隆人内皮抑素基因;hES基因转染HUVEC细胞24h,48h和72h,细胞增殖率均较正常组明显降低(P＜0.05),而脂质体对照与载体对照与对照组无明显变化.结论 hES基因能够抑制HUVEC增殖.     

从易感基因多态性探讨原发性高血压病中医证候实质的思考

认为基因背景可能是证候形成的主要原因之一,基因的这种细微差异决定其生物行为出现极大的变化.运用基因组技术寻找不同中医证型中相关基因表达谱的差异表达,对研究中医证型的实质及指导临床用药有重大的意义.     

真菌性角膜炎常见致病菌株——镰刀菌的AFLP指纹图谱分析

目的采用AFLP对镰刀菌进行基因分型。方法对镰刀菌分离、纯化、重新鉴定后,用CTAB法提取其DNA。经EcoRI和MseI双酶切,对酶切片段进行预扩增和选择性扩增。扩增后的产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染成像。结果用20株镰刀菌作材料,筛选出3对多态性较高、带型质量较好的AFLP引物,分别是E-TCM-CAA,E-TAM-CTT,E-TAM-CAC。各菌株间的相似率为74%～90%,在SM=0.74(74%)的相似性水平上,镰刀菌明显地分为2种。14株茄病镰刀菌种内可分为9型,6株串珠镰刀菌种内可分为4型。结论AFLP可用于真菌性角膜炎常见致病菌株即镰刀菌的基因分型。