rDNA介导的乳酸克鲁维酵母整合型表达载体的构建及初步验证

构建一个适用于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)稳定的整合型表达载体,并通过鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)来源的腺苷酸脱氨酶基因(AMPD)的表达对该载体进行初步验证。以质粒pMD 19T-simple为空骨架,K. lactis GG799来源的18S rDNA序列为同源重组位点,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的半乳糖苷酶启动子(pScGAL7)为外源基因调控元件,乙酰胺酶基因(amdS)为筛选标记,AMPD为报告基因,构建重组表达载体pTRGA-amdS。载体经Sac Ⅱ线性化后,去除了大肠杆菌(Escherichia coli)来源的ori和氨苄青霉素抗性基因(Ampr),将同源重组片段电转化K. lactis GG799得到重组菌,利用实时荧光定量PCR (RTQPCR)测定重组菌AMPD基因整合拷贝数为1～3,AMP脱氨酶酶活测定结果表明:酶活与拷贝数呈正相关,含3个整合拷贝的重组菌在半乳糖诱导下酶活提高了32.6%,达到(590±13.33) U/mL。在无选择压力下重组菌连续生长58世代稳定性为98.59%。通过载体pTRGA-amdS的构建与应用实现了外源基因在K. lactis中的稳定表达,初步探究了18S rDNA在同源重组中的作用,为K. lactis的进一步分子改造提供参考。     

9味中药对鸡腿蘑深层发酵的影响

研究中药对鸡腿蘑深层发酵中生物量和胞外粗多糖的影响。本文采用将中药固体粉末分别加入培养基巾接种培养，培养4d后测定生物量和胞外粗多糖。结果表明，除黄芪、玉竹外，绞股蓝、苦荞、魔芋、百合、人参、丹参和苦瓜都能促进鸡腿蘑的生长和胞外多糖的分泌。不同中药量添加的结果显示，人参的最适添加量为1．5％，绞股蓝、苦荞、魔芋、百合、丹参和苦瓜的最适添加量均为0．5％。     

液体深层发酵鸡腿蘑抑菌活性的研究

研究了鸡腿蘑液体深层发酵的胞内和胞外产物对霉菌的抑制作用，并且进一步研究了胞外发酵液的最小抑菌浓度（MIC）、pH对其抑菌活性的影响以及热稳定性。结果表明，胞外发酵液对青霉和黄曲霉有较强的抑制作用，对黑曲霉和黑根霉的抑制作用不明显，对胞内产物无任何抑制作用；对青霉的最小抑菌浓度（MIC）是浓缩3倍时，对黄曲霉是浓缩4倍时；在pH3．5-5．5之间抑菌海出陵强，且热稳定性较好。     

基于抑制非酶糖基化效果的金耳液体发酵

非酶糖基化是引起糖尿病并发症的主要因素之一,因此抑制非酶糖基化反应成为控制糖尿病并发症的重要手段。作者以抑制非酶糖基化反应活性为指标,对金耳液体发酵培养基和发酵条件进行了优化。培养基经正交实验优化后,最优培养基组成为:葡萄糖10 g/L,蛋白胨5 g/L,玉米粉20 g/L,麸皮15 g/L,CoCl20.5 g/L,MnSO40.5 g/L。最适发酵条件为:培养温度25℃,培养基初始pH 6.5,500 mL三角瓶装液量150 mL,接种体积分数10%。经发酵条件优化后,金耳发酵液对非酶糖基化抑制率达89.74%。在对金耳发酵液活性物质分析中发现,金耳发酵液对非酶糖基化的抑制作用是由金耳多糖及其它小相对分子质量物质共同作用的结果。     

石蒜(Lycoris radiate.Herb)鳞茎浆料流体特性及其用于酒精发酵的研究

通过分析石蒜鳞茎制浆所得浆料的静态及动态流体学特性,讨论该浆料用于酒精发酵的可行性。结果表明,鳞茎浆料具备典型粘弹性流体性质以及其粘性起主导作用。分别利用葡聚糖酶、木聚糖酶及果胶酶与浆料反应以降低其粘性,均表现出有效降粘效果。并探讨了这三种不同酶预处理分别对同步糖化发酵工艺利用浆料发酵酒精过程的影响,结果显示,浆料经果胶酶预处理后,酿酒酵母培养70h产酒精1.9%(w/w)为最高。浆料中石蒜生物碱可能对酵母某些代谢途径产生抑制。文章最后提出对石蒜属植物的综合生物炼制策略,以期实现对本属植物的高效开发。     

灵芝转化小球藻发酵液粗多糖对荷瘤小鼠免疫功能的影响

在灵芝基础培养基中添加蛋白核小球藻粉,灵芝能对小球藻细胞进行生物破壁,同时进行生物转化。提取转化多糖,与基础培养基所产多糖进行比较,研究对荷瘤动物免疫功能的影响。结果表明,产生的转化多糖能显著提高荷瘤小鼠白细胞的数量、脾细胞增殖能力和单核巨噬细胞吞噬能力等免疫学功能功能,对其他免疫调节功能也有一定的提高作用,从而显著地提高了抑瘤效果。     

白丝北里孢菌L-谷氨酸氧化酶的异源表达及酶学性质分析

为实现从L-谷氨酸到α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid,α-KG）的高效生物转化,将来源于白丝北里孢菌（Kitasatospora setae KM-6054）的L-谷氨酸氧化酶（L-glutamate oxidase,LGOX）在大肠杆菌（Escherichia coli）中实现异源表达,并研究其酶学特性。根据LGOX的氨基酸序列和大肠杆菌系统偏好性合成LGOX全基因序列,并通过pET28a（＋）/DE3系统在大肠杆菌中实现了功能表达。诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）终浓度为0.1?mmol/L,20?℃诱导18?h,重组大肠杆菌粗酶液酶活力可达49.10?U/mL。亲和层析获得酶比活力为45.98?U/mg纯酶,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳条带显示蛋白分子质量大小约为70?kDa。酶学性质研究表明：其最适反应温度和pH值分别为40?℃和6.0;Km值为1.23?mmol/L,Vmax值为76.24?μmol/（min·mg）,L-谷氨酸为该酶的最适底物。本研究确定了LGOX在E.?coli?BL21中的异源表达及酶学特性,为生物转化合成α-KG提供了新的参考途径。     

铁皮石斛茎部和叶部多糖的性质和活性

铁皮石斛是一种含有多种活性物质的名贵中药,目前主要利用其茎部进行活性和结构等方面的研究。作者通过研究和比较铁皮石斛茎部和叶部中的各种物质的质量分数和分布,发现茎部与叶部中物质组成相同,但茎部中多糖和石斛碱质量分数分别是叶部的2.71和3.02倍,而脂溶性成分和粗蛋白在叶部的质量分数要明显高于茎部。将提取后的茎部和叶部多糖进行分析,发现两种多糖的单糖组成具有较大差异,茎部多糖主要由甘露糖和葡萄糖组成,摩尔比为3.07∶1,叶部多糖主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成,摩尔比为8.81∶1∶0.57∶0.37。此外,茎部和叶部多糖特性粘度分别为56.26、8.05 dL/g,与之对应的相对分子质量分别为1 207000和318 000,为高相对分子质量高粘度的生物大分子。在抗氧化活性实验中,清除DPPH自由基的结果显示,叶部多糖明显优于茎部多糖,表明其具有较高的抗氧化应用价值。在对提取条件中的温度、提取时间和料液比进行考察后,最终确定了茎部和叶部多糖提取的最优条件。     

D-甘露糖异构酶的酶学性质探究和热稳定性改造

D-甘露糖异构酶可以催化D-果糖与D-甘露糖之间的相互转化，在D-甘露糖的生物酶法制备中具有应用前景，但是目前报道的D-甘露糖异构酶热稳定性较差，无法满足工业生产高温的需求。该研究将大肠杆菌(Escherichia coli) Dh5α来源的D-甘露糖异构酶异源表达后进行酶学性质研究，并对其进行热稳定性改造。研究结果显示D-甘露糖异构酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH值为6.0～7.0,K_m、k_cat和k_cat/K_m分别为963.4 mmol/L、1.38 s^-1、1.4×10^-3 L/(mmol·s)。通过理性改造该研究获得了一株热稳定性显著提高的突变体A241P/A116V/G253A/Q379P,其最适反应温度提高了15℃,在50℃条件下，半衰期为野生型的33倍，相对酶活力比野生型高60%。分子动力学模拟分析表明脯氨酸的引入和疏水作用的增强，提高了蛋白质的刚性，从而使热稳定性提高。该研究通过对主流来源的D-甘露糖异构酶进行酶学性质探究及热稳定性改...