丝状真菌三孢布拉霉原生质体制备及再生条件的研究

丝状真菌三孢布拉霉原生质体形成和再生的条件;培养７ｈｒ的幼龄菌丝体,用１％溶壁酶和１％纤维素酶混合酶液处理,以０．６Ｍｏｌ／Ｌ蔗糖作为渗透压稳定剂,２８℃酶解３ｈｒ。形成原生质体量达到８．０＊１０＾６个／ｍｌ原生质体的固体法再生率为１．４％,液体法再生率为４０％。     

面包酵母原生质体融合

面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）两亲株原生质体的制备,是用对数生长早期的细胞,在蜗牛酶和17%蔗糖、20u/ml青霉索的作用下完成的,3060分钟内原生质体的形成率达8592%．两亲株的原生质体在35%PEG（M．W．6000）,0.4M CaCI2条件下被诱导融合．融合频率为10－410－5．     

金针菇与平菇远缘亲本原生质体融合研究

以菌龄5 d的菌丝体为原料,采用1.5 %溶壁酶和1.5 %蜗牛酶酶液,酶解3 h,酶解温度为30 ℃,0.6 mol/L KCl为渗透压稳定剂,制备得到金针菇和平菇原生质体。两种原生质体融合后,25 ℃静置培养2 d随后涂布于再生培养基。以34 ℃菌丝培养温度作为标记筛选出融合子,融合的细胞在马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基中实现再生,通过菌丝形态、细胞学观察、拮抗性试验、出菇试验验证再生出的为融合子,最终从18个再生菌株中选择出1株耐34 ℃高温菌株可进行出菇试验,且融合菌株子实体粗壮、原基形成较多、菇形好的金针菇新品种,命名为F1P8。     

杏鲍菇原生质体制备、再生及其遗传转化体系的建立

为优化杏鲍菇GIM5.344 原生质体的制备、再生条件及建立稳定有效的遗传转化体系,对裂解酶、酶解温度、酶解时间、再生培养基稳渗剂等原生质体制备、再生条件以及潮霉素浓度、聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）介导转化方法进行优化,探究不同原生质体制备、再生条件对原生质体产量和再生率的影响。结果表明：选用溶壁酶1 进行酶解效果最佳,当酶解温度30 ℃、酶解时间2 h、再生培养基稳渗剂为甘露醇时,原生质体的产量可达到7×108 CFU/mL,再生率达到0.40%。得到转化子最多的转化方法为固体预培养+双层培养法,即PEG 介导转化后在无抗性再生培养基上28 ℃预培养48 h,然后再添加一层含有30 μg/mL 潮霉素的培养基进行拟转化子的筛选。所得转化子中的绿色荧光蛋白基因能稳定有效表达。     

α-ALDC产生菌的抗性标记与融合条件初探

利用青霉素和链霉素分别对α-ALDC产生菌枯草芽孢杆菌3226-5、V-20进行抗药性标记,筛选得到稳定的青霉素抗性标记株P-67和链霉素抗性标记株S-17,并以P-67和S-17为融合的亲本在溶菌酶浓度,酶解时间,酶解温度,PEG浓度和pH等不同的条件下进行原生质体融合,从而确定了其融合的最佳条件。     

原生质体融合结合基因编辑技术显著提高酿酒酵母2-苯乙醇产量

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)已用于生产天然2-苯乙醇(2-phenylethanol, 2-PE),但其产量低，耐受性差。该研究筛选出3株具有不同优良性状的酿酒酵母菌株，其中菌株LSC-1的2-PE产量为3.41 g/L,菌株NGER对2-PE的耐受性达3.60 g/L,菌株S.C-1耐热性好并能在41℃下生长。以这3株菌为亲本，通过2轮原生质体融合获得融合子菌株RH2-16,对2-PE的耐受性提高了20%。以L-苯丙氨酸为底物，发酵转化36 h, 2-PE产量达到4.31 g/L,与亲本菌株LSC-1和2-PE工业生产菌株CWY132相比，分别提高26.4%和38.1%。利用CRISPR/Cas9系统，在RH2-16中构建了含突变的Ras特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子CDC25(W1416C)菌株，2-PE的产量提高了8%。在RH2-16中过表达艾氏途径合成2-PE关键基因ARO8,ARO10和ADH2未能提高2-PE产量。研究为筛选合成2-PE等天然产物的新型酿酒酵母菌株及其育种提供了一种有效策略。     

六妹羊肚菌原生质体单核化再生菌株的杂交分析

该研究在对六妹羊肚菌（Morchella sextelata）原生质体单核化再生菌株分离及交配型鉴定的基础上，对单交配型原生质体再生菌株进行对峙培养杂交实验制备杂交菌株。以菌株交配型、生长势、抗鞣酸能力和菌核产生能力为技术指标，对单核化再生菌株及杂交菌株的多态性进行分析，并对杂交菌株的交配型进行检测。结果表明，20株MAT1-1-1单交配型及17株MAT1-2-1原生质体再生菌株表现较好，其菌丝带宽度均≤10 mm，褐变圈直径分别为25～34 mm、23～34 mm；从63组杂交菌株中得到40株（占63.50%）双交配型（MAT1-2-1/MAT1-2-1）杂交菌株，杂交菌株的菌丝带宽度均≥10 mm，褐变圈直径为32～54 mm，杂交菌株的交配型电泳结果表明，成功获得40株具有双交配型的杂交菌株（两条扩增带）。因此，双交配型杂交菌株在生长势、抗鞣酸能力方面存在杂交优势，而菌核产生能力与菌株交配型没有相关性。     

松乳菇与平菇原生质体杂交及其融合菌株的特性

以双灭活原生质体作为遗传标记,将高产的平菇与松乳菇进行融合杂交。采用菌落表型比较、拮抗试验、酯同工酶及全蛋白电泳图谱比对鉴定融合菌株,用比色法和重量法分别测定融合菌株与其亲本的4种酶的活力和生物量。试验结果表明:融合菌株形成了稳定的新遗传性酶谱;具有更强利用基质的能力,淀粉酶、羧甲基纤维素酶、漆酶活力分别为亲本松乳菇的377.32%,194.83%,149.64%,亲本平菇的539.27%,209.26%、195.24%,而木聚糖酶活力介于两亲本之间。融合菌株鲜干菌丝重高达亲本松乳菇的168.09%,149.92%,平菇的525.02%,253.79%。融合菌株R6可作为高产发酵生产菌丝体的起始菌株。