基于RPA-LFD法的多黏菌素耐药基因mcr-1可视化快速检测方法建立与应用

目的：建立一种快速、高效、可视化的细菌多黏菌素耐药基因mcr-1检测方法，为其基层检测的展开提供依据和便利。方法：利用重组酶聚合酶扩增结合胶体金侧向流试纸条技术(Recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick,RPA-LFD)，辅以手持式胶体金读数仪；根据mcr-1基因保守序列设计合成一对特异性RPA引物，通过对反应条件和体系的优化，以及特异性试验、灵敏度试验、模拟食样试验和实际样品试验，成功建立了可视化定量检测细菌多黏菌素耐药基因mcr-1的RPA-LFD方法。结果：在引物浓度400 nmol/L，引物比例1:1时，该方法最佳反应条件为Mg²⁺浓度14.0 mmol/L，反应温度37℃，反应时间20 min；灵敏度好，标准曲线方程为y=0.117x+0.051，定量限为10¹～10⁸ copies/μL，检出限为10¹ copies/μL，比PCR法低一个数量级且模拟样品检出结果与PCR法一致。利...     

微波辅助孵育法富集麦胚多肽的工艺优化

目的 麦胚孵育过程中蛋白酶将蛋白质水解成肽和氨基酸，多肽具有明确的生理活性和营养调节作用。本研究以麦胚为试验原料，采用微波辅助预处理的方法，研究孵育的温度、时间、pH及料液比4种因素对孵育后的蛋白酶活力及多肽含量的影响。 方法 通过单因素和响应曲面试验进行工艺条件优化。 结果 与未进行微波辅助预处理的样品相比，微波辅助处理（600 W, 10 s）能显著提高孵育后样品中的蛋白酶酶活力（约9.4倍）和肽含量（约3.1倍）。经过微波辅助处理后，孵育温度为51.5℃、pH为4.0、时间为6.33 h、料液比为1:7时，蛋白酶活力达最高为3826.24 U/g；孵育温度为45.0 ℃、pH为4.8、时间为8 h、料液比为1:7时，肽含量达最高为262.63 mg/g。 结论 微波辅助处理能有效的激活麦胚孵育液中的内源性蛋白酶活性，促进蛋白水解反应，显著提高孵育后的肽含量。该研究结果为麦胚多肽的制备新工艺开发提供了研究基础。     

菌酶协同改善花生粕的饲用品质

花生粕是重要的蛋白饲料原料，但由于其氨基酸不平衡，特别是精氨酸与赖氨酸比例严重失衡（精氨酸与赖氨酸含量比值在3~4，理想的精氨酸与赖氨酸含量比值为1.0），限制了其在动物养殖中的应用。研究了复合酶预处理结合乳酸菌发酵花生粕对其品质的改善。结果表明：经菌酶协同处理后，花生粕粗蛋白质含量由46.4%提高至506%，大分子蛋白明显降解为小分子蛋白，酸溶蛋白质含量由2.3%提高至17.8%，多肽含量由1.6%提高至15.7%，蛋氨酸和赖氨酸含量分别提高了77.1%和42.0%，精氨酸降解率为18.7%，精氨酸与赖氨酸含量比值从3.7降低至2.1，总酸含量由06%提高到4.7%，其中乳酸含量由0.64 mg/g提高至14.63 mg/g。菌酶协同处理后的花生粕抗氧化性明显增强，其中每克菌酶协同处理后的花生粕对羟自由基的清除能力与171.6 mg VC相当，比花生粕（与47.6 mg VC相当）提高了2.6倍。     

盐分胁迫对烤烟叶片亚细胞结构及生理生化指标的影响

  目的  探究不同浓度NaCl和Na₂SO₄溶液对烤烟叶肉细胞超微结构以及对叶片抗氧化系统的影响。  方法  利用透射电镜对不同浓度的盐溶液处理下烤烟叶肉细胞进行观察，并检测其抗氧化酶活性。  结果  在低浓度盐溶液（100 mmol/L NaCl和50 mmol/L Na₂SO₄）处理条件下，烤烟叶肉细胞壁厚度有所减小，细胞内各细胞器无明显变化。中等浓度NaCl（200 mmol/L）处理条件下，烤烟叶肉细胞的叶绿体背膜边缘模糊，嗜锇颗粒增多，淀粉粒含量减少；线粒体内出现空泡，嵴减少，部分膜结构边缘模糊；细胞核核仁密度降低，核膜凹凸不平。中等浓度Na₂SO₄（100 mmol/L）处理条件下，叶绿体基粒片层间空隙增大；线粒体形态饱满，但内膜凹陷；细胞核染色质分布均匀，但核仁边缘模糊。高浓度NaCl（400 mmol/L）使烤烟叶肉细胞叶绿体基粒片层结构失去完整性；线粒体结构瓦解，几乎没有完整结构的嵴。高浓度Na₂SO₄（200 mmol/L）处理条件下，叶绿体肿胀，变为球形，内膜及部分基粒片层溶解，淀粉颗粒进一步减少；线粒体内膜溶解，基质密度降低；细胞核核仁解体，甚至溶解消失。随着NaCl和Na₂SO₄浓度的升高，过氧化氢酶活性逐渐增强；丙二醛含量和超氧化物歧化等酶活性先升高后降低；过氧化物酶活性先降后升之后再降低。  结论  烤烟对Na₂SO₄溶液的耐受能力强于NaCl溶液。      

影响多步脱氢酶CrtI功能的关键结构特征探索

在生物体内存在可催化多步连续反应的通用酶，对生物代谢过程具有重要作用。八氢番茄红素脱氢酶（CrtI）作为典型代表,可以催化多步连续脱氢反应,生成番茄红素等具有重要价值的产物。本文以酿酒酵母为底盘研究CrtI的催化功能特征。首先通过组合设计与筛选番茄红素合成路径中的三种外源酶CrtE、CrtB和CrtI，发现CrtI是主要的限制因素，且三孢布拉氏霉菌来源的CrtI(BtCrtI)表现出优异的催化功能。通过生物信息学与蛋白结构分析发现BtCrtI的S311残基是连接和稳定活性中心结构的关键。随后通过分析该位点的饱和突变结果，揭示了该位点的氨基酸残基类型对活性中心结构和功能的显著作用，为酶的设计和改造提供了新的思路。同时发现CrtI的活性差异未对合成路径中的类胡萝卜素的代谢流造成扰动，表明CrtI是番茄红素的产量和纯度的决定因素。     

漆酶的吸附固定及其对双酚A的降解

以介孔硅为载体,采用吸附法将漆酶固定。结果表明,酶固定量为30.3 wt%,活性回收率14.52%,ADS/Lac的米氏常数K_m和反应速率V_(max)分别为29.60μM和0.025μM/min,而游离酶的米氏常数K_m和反应速率V_(max)分别为20.32μM和0.045μM/min,说明固定后酶的亲和力降低,同时反应速率也降低,而稳定性得到了一定的提高。将ADS/Lac应用于双酚A模拟废水的降解时,发现在pH=5时,双酚A的降解效果最好,且降解能力优于游离酶,也可以实现重复利用。     

抗甲硝唑单链抗体融合蛋白的表达及其ELISA检测方法建立

为实现甲硝唑单链抗体(single-chain variable fragment,scFv)在大肠杆菌中的可溶性表达,以甲硝唑抗体可变区基因(VH、VL)为模板,扩增甲硝唑的scFv基因,scFv双酶切后与PLIP6/GN载体重组,构建重组质粒PLIP6/GNscFv,转化大肠杆菌JM109,阳性克隆转大肠杆菌BL21经温度诱导表达重组单链抗体,并通过聚丙酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)对其鉴定。采用竞争酶联免疫(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明诱导表达的scFv分子量接近33 kDa,能够特异性识别兽药甲硝唑,半抑制率(IC50)为(0.72±0.04)ng/mL。选择虾样品进行添加回收试验,建立的方法检测其回收率在88.54%到113.27%之间。这说明成功构建重组质粒PLIP6/GN-scFv并实现可溶性表达并可用于实际样品检测。     

高温酸性脂肪酶产生菌Acinetobacter sp. Lip-55的筛选、鉴定及其酶学性质研究

从云南大理市弥渡县石夹泉热泉的55℃底泥中筛选到1株高温脂肪酶的高产菌株,进行显微形态及生理生化特征、16S rRNA基因序列分析,将其初步鉴定为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)的一株菌,命名为Acinetobacter sp. Lip-55。对其生长条件及酶学性质进行了研究,结果表明,该菌株耐高温性较好,菌株在55℃仍能生长,菌株最适生长温度为37℃。所产脂肪酶最适酶活温度为55℃,最适反应pH值为5.0。该酶在25℃以下,能保持良好的稳定性,Zn~(2+)、Ca~(2+)、Mg~(2+)对该酶有一定的抑制作用,Mn~(2+)、K~+、Fe~(2+)、Cu~(2+)均对该酶活力起到促进作用,其中Fe~(2+)的促进效果最为显著。     

卤醇脱卤酶催化合成(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的工艺优化

以卤醇脱卤酶重组湿菌体E. coli BL21（pET28a-HHDH）为催化剂，催化外消旋的1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的动力学拆分可以获得光学纯的(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇。本文系统地研究了卤醇脱卤酶催化合成光学纯(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的影响因素，对反应pH、反应温度、菌体浓度、亲核试剂 {\mathrm{N}}_{\mathrm{3}}^{-} 浓度和底物浓度进行了探究。结果表明，卤醇脱卤酶催化合成(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的最佳工艺条件为：pH为7.0，反应温度为28℃，菌体浓度为22.5g/L，亲核试剂NaN₃的浓度为50mmol/L，底物外消旋1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的浓度为10mmol/L。在此工艺条件下，(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的ee值和收率分别为100%和16.97%。     

流感减毒活疫苗诱发黏膜IgA抗体间接ELISA检测方法的优化及其实验室内控品的制备

目的优化流感减毒活疫苗诱发黏膜IgA抗体的ELISA检测方法,并制备IgA抗体实验室内控品。方法采用ELISA检测法对流感病毒抗原(全病毒及其相应HA抗原)及包被浓度(0. 5、1、2、4μg/mL)、封闭液(1%BSA、10%FBS、5%脱脂奶粉)及封闭时间(1、1. 5、2 h)、样本稀释液(含1%BSA的PBST、含2%脱脂奶粉的PBST、样本保存液)及样本作用时间(45、60、75 min)、酶标抗体稀释度(1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000)进行优化。采用优化的方法制备针对H1N1、H3N2和B型3个型别流感病毒的IgA抗体检测用实验内控品,并用该方法对接种三价流感减毒活疫苗的20名志愿者的鼻咽拭子样本进行检测。结果最适间接ELISA法检测条件为:以全病毒作为包被抗原,包被浓度为1μg/mL;以含1%牛血清白蛋白为封闭液封闭2 h;样本稀释液为2%脱脂奶粉的PBST,作用时间为60 min;酶标抗体稀释度为1∶1 000。采用优化方法制备的H1N1、H3N2、B型IgA抗体阳性实验室内控品几何平均滴度分别为23、45、35,可接受范围分别为16～32、32～64、32～64。接种疫苗后20名志愿者中3种型别IgA抗体滴度较接种前均显著增高(P 0. 001),40%～50%志愿者接种后IgA抗体滴度比接种前至少升高2倍。结论成功优化了流感减毒活疫苗诱发黏膜IgA抗体的ELISA检测方法,制备的IgA抗体的实验室内控品可用于流感减毒活疫苗接种后鼻咽拭子抗体的检测。