单环刺螠纤溶酶UFE-Ⅱ的分离纯化及其酶学性质

目的分离纯化单一组分的单环刺螠纤溶酶UFE-Ⅱ,并分析其酶学性质。方法单环刺螠体腔液经离心、超滤、离子交换层析、凝胶过滤等方法进行分离纯化,得到单一洗脱峰酶组分,经Native-PAGE、SDS-PAGE和飞行质谱分析,测定其纯度和相对分子质量;并以酪蛋白为底物,Folin-酚试剂法测定酶活力,对其酶学性质进行分析。结果分离纯化的UFE-Ⅱ具有水解纤维蛋白的活性,其水解酪蛋白的比活力达到375.6U/mg,纯化倍数为10.3倍,回收率为14.0%。UFE-Ⅱ为单一组分,纯度达99%以上,相对分子质量为24329。UFE-Ⅱ的最适反应温度约为45℃;最适反应pH值为7.0;Ca2+、Mn2+和Fe2+是该酶的强激活剂;Fe3+、Cu2+和Pb2+对该酶活力具有一定的抑制作用;SBTI和PMSF能完全抑制酶活力,表明该酶为丝氨酸蛋白酶;糜蛋白酶抑制剂可部分抑制酶活力,亮抑酶肽、抑蛋白酶肽、苯甲脒可较弱地抑制酶活力。结论从单环刺螠体内成功分离纯化出纤溶酶UFE-Ⅱ,并分析了其酶学性质,该酶具有进一步开发利用价值。     

氨基葡萄糖对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能的影响

目的探讨氨基葡萄糖对小鼠腹腔巨噬细胞(PMФ)免疫功能的影响。方法用壳聚糖制备氨基葡萄糖纯品,通过体外实验测定其对小鼠PMФ增殖、吞噬中性红、产生NO和IL-1能力的影响。结果氨基葡萄糖能够显著增强PMФ对中性红的吞噬能力,提高NO和IL-1的生成量,而对PMФ的增殖能力无明显影响。结论氨基葡萄糖能够活化PMФ,增强小鼠的免疫功能。     

海蚯蚓蛋白酶基因的原核表达及其抗肿瘤活性

目的原核表达海蚯蚓蛋白酶基因,探讨其对肿瘤细胞增殖的抑制作用。方法根据环节动物门蚯蚓和单环刺螠丝氨酸蛋白酶c DNA序列多重比对获得的保守序列设计引物,从海蚯蚓肠道组织提取总RNA,经3′RACE和5′RACE技术分别克隆海蚯蚓蛋白酶c DNA序列的3′端和5′端,并进行拼接,对其编码的蛋白质作生物信息学分析;将海蚯蚓蛋白酶成熟肽的编码序列亚克隆至原核表达载体p ET-21a(+),转化大肠埃希菌BL21(DE3)进行诱导表达,采用组氨酸亲和层析柱纯化;MTT法检测重组蛋白的抗肿瘤活性。结果经3′端RACE技术获得约250 bp的海蚯蚓蛋白酶基因c DNA 3′端序列,再经5′RACE技术扩增获得约770 bp的c DNA 5′端序列,拼接可得海蚯蚓蛋白酶c DNA序列全长为880 bp,其编码蛋白含270个氨基酸,具有高度保守的GDSGGP序列;重组蛋白相对分子质量为27 000,主要以包涵体形式表达,约占菌体总蛋白的30%,上清纯化后纯度可达95%;重组蛋白酶对人肿瘤细胞增殖具有明显的抑制作用。结论原核表达了海蚯蚓蛋白酶,可明显抑制人肿瘤细胞的增殖,为抗肿瘤基因工程药物的研发提供了实验依据。