来源于P.bacterium 1109的甘露醇脱氢酶的重组纯化及酶学性质研究

本文将来自P.bacterium 1109的甘露糖醇脱氢酶(MDH)表达并提取纯化,研究了该重组酶的酶学性质及其在甘露醇生产中的工艺条件。结果显示重组MDH是一个相对分子量为37 kDa的四聚体。氨基酸序列比对发现其与大多数MDHs的同源性小于40%。该酶的最适pH和温度分别为8.5和80℃,且当金属离子Zn2+存在时,重组MDH的活力提高到对照组的260%。此外,重组MDH在75℃孵育6 h后仍可保留超过85%的残留活性,热稳定性较高,比大多数MDHs的活性高。底物特异性研究表明其对D-果糖具有较高的专一性。重组MDH催化D-果糖的米氏常数(K_m)和催化效率(k_cat/K_m)分别为20 mmol/L和7.5 L/(mmol·min)。重组MDH在以400 mmol/L的D-果糖为底物的反应系统中,可将80%以上的D-果糖转化为甘露糖醇。通过对反应条件的优化,为后续工业化生产制备甘露醇奠定了基础。     

代谢工程改造大肠杆菌合成反式-4-羟基-L-脯氨酸

通过比对筛选,从Micromonospora sp.CNB394中获得高活性的L-脯氨酸-4-羟基化酶,随后利用规律成簇的间隔短回文重复-associated protein 9基因编辑方法,通过强化L-脯氨酸合成途径和引入高活性的L-脯氨酸-4-羟基化酶,构建1株以葡萄糖为碳源合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌基因工程菌HYP15。摇瓶发酵30 h,工程菌的反式-4-羟基-L-脯氨酸产量达到13.6 g/L。5 L发酵罐分批补料发酵40 h,反式-4-羟基-L-脯氨酸产量达到48.6 g/L,糖酸转化率和平均生产强度分别达到21.6%和1.22 g/(L h),具有良好的工业应用前景。     

蜂毒肽在大肠杆菌中的高效融合表达与纯化

生物法制备蜂毒肽是实现大量制备蜂毒肽的关键技术。为实现蜂毒肽的高效表达，通过化学法合成含信号肽、前导肽和成熟肽的蜂毒肽基因promet和蜂毒肽成熟肽基因met，与麦芽糖结合蛋白基因mbp连接，克隆到载体pET15-b，构建重组质粒pET-MBP-MET和pET-MBP-proMET。重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3），以0.1 mmol/L IPTG进行诱导，30 ℃下过夜诱导，融合蛋白MBP-MET、MBP-proMET在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达。两种目标蛋白质经Ni柱和Dextrin Sepharose HP两步亲和纯化，得到了纯度达90%以上的融合蛋白MBP-MET、MBP-proMET，培养1 L大肠杆菌菌液能制备约20 mg纯蛋白质。通过牛津杯抑菌实验发现，MBP-MET、MBP-proMET能明显抑制细菌生长，产生明显的抑菌圈，MBP-MET和MBP-proMET最低抑菌浓度（MIC）分别为100 μg/mL和140 μg/mL。本研究首次实现了蜂毒肽的高效表达，并进行了抑菌功能验证，为生物法制备蜂毒肽提供了高效、安全的合成途径。     

多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

为了使新普鲁兰酶基因在大肠杆菌中表达并实现高密度发酵生产,采用PCR方法从多粘类芽孢杆菌基因组DNA中扩增出新普鲁兰酶基因Npu,测序结果表明Npu基因全长2106 bp,编码515个氨基酸,与其他多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因序相似性高达99%。将Npu基因连接到质粒PMD18T上,构建了PMD18T-Npu vecter重组载体。将该重组载体转化到大肠杆菌BL21中,该酶基因在大肠杆菌细胞中获得活性表达,并能将酶蛋白分泌到胞外。重组菌株BL21 PGEX 4T-1-Npu具有较好的遗传稳定性,连续传代培养10代,菌株所产酶总酶活性仍保持在715 U;纯化后的酶液于25 ℃保存6个月酶活性仍保持在5427 U,于4 ℃保存12个月酶活性仍保持在5390.5 U。这是首次对来源于类芽孢杆菌属(paenibacillus)的普鲁兰酶进行报道,由于Npu具有较好的水解淀粉支链的能力,因此其在淀粉加工业以及洗涤业上应用前景良好。     

产志贺毒素大肠杆菌O26多重双启动寡核苷酸引物-PCR检测方法的建立

为建立一种三重DPO-PCR方法用于食品样品中的产志贺毒素大肠杆菌O26的检测。以志贺毒素stx1和stx2、O抗原基因wzx O26特异性和实际检测效果,设计引物,构建三重DPO-PCR反应体系,进行特异性、灵敏度、模拟样品验证和实际样品验证。结果表明,三对DPO引物对退火温度不敏感,在49~69℃之间均能发生扩增,且引物之间干扰较小,具有较高的特异性,除目的基因外非目标细菌均无扩增条带出现,纯菌灵敏度检测表明,三重DPO-PCR方法对O26的最低检测限为3.8×10^3 cfu/g。在模拟样品和实际样品中具有良好的检测效果。本研究基于DPO引物构建的三重DPO-PCR方法具有效率高,特异性强,不受退火温度限制等优点,可用于食品样品中产志贺毒素大肠杆菌O26的快速准确检测提供一种高效的辅助检测方法。     

降糖肽Aglycin的高效表达及活性鉴定

基于自组装肽ELK16能在大肠杆菌细胞内自聚集的特性,本研究将Aglycin通过一个内含肽Mxe GyrA与自组装肽连接,构建能在体外自剪切的重组表达载体pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行蛋白表达条件的优化,得到目的蛋白聚集体,随后对聚集体进行DTT切割条件的优化,经过进一步纯化最终可得到纯度为98.15%、产量为5.53mg/g菌体湿重的Aglycin肽。采用基因工程手段重组表达Aglycin的产量比目前化学提取方法提高了近100倍。此外,经体外实验证明,Aglycin对α-葡萄糖苷酶抑制的IC50(36.48μmol/L)比阿卡波糖(991.33μmol/L)低,说明Aglycin比阿卡波糖有更强的α-葡萄糖苷酶抑制活性,这进一步证明Aglycin有开发为α-葡萄糖苷酶抑制剂的潜力。     

β-1，4-葡聚糖内切酶基因在大肠杆菌中分泌表达

采用重叠延伸PCR合成技术将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)分泌蛋白基因序列usp45(81 bp)和瑞氏木霉(Trichoderma reesei)β-1,4-葡聚糖内切酶成熟蛋白序列egl3(657 bp)连接成融合基因usp45-egl3,构建了分泌型重组质粒pMG36e-usp45-egl3及重组大肠杆菌E.coli DH5α/pMG36e-usp45-egl3。分析重组大肠杆菌的表达效果及表达产物降解纤维素的能力。结果表明,重组大肠杆菌DH5α/pMG36e-usp45-egl3经14 h培养能分泌酶活为226 mU/mL的β-1,4-葡聚糖内切酶,并有效地降解了羧甲基纤维素钠。其中分泌的β-1,4-葡聚糖内切酶降解羧甲基纤维素钠生成还原糖的速率为2.35 mg/(h·mL)。     

改性石墨烯包覆光纤的马赫-曾德尔大肠杆菌传感器

针对日益严峻的食品安全问题,特别是食源性致病菌的快速检测,本文提出一种基于表面改性石墨烯粗锥型马赫-曾德尔干涉结构的光纤大肠杆菌传感器。首先,截取一根4 cm的实心光子晶体光纤,两端分别与两根单模光纤进行粗锥熔接,形成基于马赫-曾德尔干涉原理的传感结构;接着,制备一种表面改性石墨烯敏感材料,将它涂覆在实心光子晶体光纤的表面,使传感器对大肠杆菌溶液有较高的灵敏度;最后,将上述传感器置于水槽中,以此检测大肠杆菌溶液浓度。实验结果表明,在大肠杆菌溶液浓度为50~600 cfu/mL内,随着菌液的浓度增大,传感器的干涉光谱发生了明显的蓝移,灵敏度为3.43 pm/(cfu·mL^-1),菌液浓度与波长偏移的线性度为0.95649,检测限为67.18 cfu/mL,响应时间为15 s。该传感器成本低、体积小、响应时间快,适用于低浓度大肠杆菌浓度的快速检测。     

大肠杆菌乙酰辅酶A代谢调控及其应用研究进展

利用生物法合成生物基化学品具有高效、绿色、可持续发展等优势。乙酰辅酶A作为细胞内物质代谢的重要中间产物，是利用生物转化法合成许多生物基化学品的重要前体，在微生物碳代谢过程中发挥着枢纽作用。本文综述了大肠杆菌乙酰辅酶A的合成、代谢调控策略及其重要应用，重点总结了乙酰辅酶A的合成途径及近期发展的提高乙酰辅酶A胞内通量的代谢调控策略，包括乙酸途径的代谢调控、丙酮酸合成乙酰辅酶A途径的代谢调控、中心碳代谢途径的代谢调控、β氧化合成乙酰辅酶A途径的代谢调控和乙酰辅酶A合成新途径的发掘，进一步展望了提高乙酰辅酶A供给的策略，利用基因组编辑技术构建合成乙酰辅酶A为前体化学品细胞工厂的方法。     

具有保护肠上皮细胞HT-29免受大肠杆菌和H2O2损伤潜力的植物乳杆菌的筛选

益生菌可在肠道定植从而发挥抗炎或抗氧化活性，有利于宿主肠道健康。本实验研究了从新疆传统发酵乳制品中分离得到的8?株植物乳杆菌对大肠杆菌侵袭和过氧化氢刺激肠上皮细胞HT-29的保护作用。结果表明：在8?株植物乳杆菌中，植物乳杆菌35具有最高的黏附能力。植物乳杆菌35可通过取代、竞争、排阻的方式抑制大肠杆菌对HT-29细胞的黏附，抑制率分别为42.60%、59.17%、60.19%。植物乳杆菌35及其多糖可抑制大肠杆菌刺激HT-29细胞产生白细胞介素-8；同时保护HT-29细胞免受过氧化氢的损伤，增加超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力水平并降低丙二醛含量。结论：植物乳杆菌35及其粗胞外多糖具有抑制大肠杆菌O157诱导的炎症性肠病的潜力。