变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸操纵子的克隆与分析

从变形假单胞菌JUIM01中克隆2-酮基葡萄糖酸操纵子(kgu操纵子),明确其基因组成及生物学信息。根据报道的假单胞菌的基因组信息设计简并引物,采用LA-PCR技术克隆变形假单胞菌的kgu操纵子,对克隆的基因片段进行测序,在此基础上利用生物信息学方法进行分析。结果表明:克隆到的基因片段全长为6 130bp,其中包括基因ptx S、kgu E、kgu K、kgu T和kgu D,分别编码2-酮基葡萄糖酸代谢调控蛋白Ptx S、2-酮基葡萄糖酸差向异构酶、2-酮基葡萄糖酸激酶、2-酮基葡萄糖酸转运蛋白和2-酮基葡萄糖酸-6-磷酸还原酶;这些基因与铜绿假单胞菌PAO1的kgu操纵子中相应基因的序列一致性达56.15%~76.74%,然而变形假单胞菌的ptx S很可能并不位于kgu操纵子中。研究首次从变形假单胞菌中克隆到kgu操纵子,并对其进行生物信息学分析,为变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸代谢机理的研究奠定了基础。     

变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶基因的原核表达

采用降落聚合酶链式反应(touchdown polymerase chain reaction,TD-PCR)技术,从2-酮基葡萄糖酸工业生产菌株变形假单胞菌JUIM01中克隆了编码2-酮基葡萄糖酸差向异构酶的基因kgu E。将目的基因与质粒pET-28a(+)重组后转入宿主表达菌中,获得了重组菌株大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-kgu E。在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的诱导下,该重组菌株表达了一个分子质量约为30.5 ku的融合蛋白,且该蛋白的Western-blot鉴定结果显示为阳性。生物信息学分析结果表明,该蛋白是一种由256个氨基酸残基组成的分子质量为28.5 ku的亲水性蛋白,与恶臭假单胞菌的2-酮基葡萄糖酸差向异构酶在氨基酸序列上的一致性达78%,定位于细胞质中,其二级结构中α-螺旋、延伸链和无规则卷曲所占的比例分别为40.62%、17.19%和42.19%。本研究结果为变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶的功能研究提供了一定理论支持。     

变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸激酶基因的克隆、表达及生物信息学分析

采用聚合酶链式反应技术,从2-酮基葡萄糖酸工业生产菌株变形假单胞菌JUIM01中克隆2-酮基葡萄糖酸激酶的全长基因kguK,并在此基础上构建了重组菌株大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-kguK。在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的诱导下,该重组菌株表达了一个特异的分子质量约为36.0 ku融合蛋白,且该蛋白的Western-Blot鉴定结果显示为阳性。生物信息学分析结果表明,该蛋白是一种由305个氨基酸残基组成的亲水性蛋白,定位于细胞质中,存在着与pfkB家族蛋白类似的保守结构域,其二级结构中α-螺旋、延伸链和无规则卷曲所占的比例分别为35.73%、12.79%和51.48%。     

荧光假单胞菌JD1202利用大米淀粉水解糖连续发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸

研发荧光假单胞菌JD1202转化大米淀粉水解糖为2-酮基-D-葡萄糖酸的连续发酵工艺.考察了连续发酵起点、稀释率和补料培养基中葡萄糖浓度对2-酮基-D-葡萄糖酸生产的影响.结果表明,稀释率和葡萄糖浓度对2-酮基-D-葡萄糖酸发酵具有显著影响;在稀释率和补料培养基成分保持不变的条件下,2-酮基-D-葡萄糖酸大量合成期的任何时段均可作为连续发酵的起点,其细胞浓度、残糖浓度和2-酮基-D-葡萄糖酸浓度均稳定在一定范围.较适的连续发酵操作条件为:稀释率0.065h-1,补料培养基中葡萄糖的质量浓度为170.0g/L.在此条件下,连续发酵达到稳态时发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的质量浓度为130.34g/L,生产强度平均为8.47g/L·h,发酵转化率为89.46％.连续发酵工艺是一种高效的2-酮基-D-葡萄糖酸生产方法,有望应用于工业生产中.     

牛乳铁蛋白肽衍生物的设计及其在毕赤酵母中表达与活性分析

本文利用抗菌肽数据库以及蛋白质分析软件等工具,根据抗菌肽结构与功能的关系,对牛乳铁蛋白肽衍生肽(LfcinBD)的结构进行优化设计。将设计得到的LfcinBD基因片段与pPIC9K质粒构建重组表达载体,线性化后电转化毕赤酵母细胞GS115,利用甲醇诱导表达。实验对发酵上清液进行了分离纯化和活性测试,SDS-PAGE电泳检测到了目标蛋白的有效表达。实验还对优化设计得到的牛乳铁蛋白肽衍生肽与同等发酵条件下产生的天然牛乳铁蛋白肽的抑菌活性进行了对比分析,结果证明该衍生肽对金黄色葡萄球菌有更强的抑菌活性。研究表明经色氨酸Trp替换的牛乳铁蛋白肽中第10,14位氨基酸获得的牛乳铁蛋白肽衍生肽具有很好的抑菌活性,实验为进一步探究牛乳铁蛋白肽衍生肽生物活性的改进奠定了基础。     

Lactobacillus diolivorans二醇脱水酶的分离纯化与酶学性质

引 言 1,3-丙二醇(1,3-propanediol, 1,3-PD)是一种重要的化工和医药中间体原料,是良好的溶剂、抗冻剂或保护剂,是聚酯--聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)和聚氨酯的单体,可在地毯、纺织、工程塑料等领域中广泛应用,也可用于食品、化妆品和制药等行业食品.当前化工合成是生产1,3-丙二醇的主要方法,但需要在高温和昂贵催化剂作用下进行,并有多种副产物产生,产品分离困难,生产成本高,产生的废气对环境污染大.生物法较化学合成法具有条件温和、操作简便、副产物少、无环境污染等特点,因此如何用微生物发酵法低成本低污染地制备1,3-丙二醇已经成为各国研发者感兴趣的课题.     

巴斯德梭菌甘油脱水酶基因的克隆表达、纯化及酶学性质的研究

用聚合酶链反应(PCR)技术,从巴斯德梭菌(C lostridium pasteurianum)扩增出甘油脱水酶基因(dhaBCE),在大肠杆菌中高效表达,SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)电泳结果显示,分别有相对分子质量为66、21、16 kD三条特异性蛋白表达条带。用金属镍亲和层析及S-300H凝胶层析将重组蛋白进行分离纯化,所得纯酶的比活为4.26 U/mg。重组酶的最适反应温度42~44℃,最适作用pH=9.10~9.50,它对三个底物结构类似物的米氏常数(Km)值分别是:1,2-丙二醇0.38 mmol/L,甘油0.29 mmol/L,1,2-乙二醇2.0 mmol/L;对辅酶B12的Km值为0.22μmol/L。     

亭子口水利枢纽底孔弧形工作门控制系统设计

亭子口水利枢纽底孔弧形工作门控制系统,采用PLC控制系统,通过液压系统的自动启停,控制双作用油缸的运行,从而实现弧形工作门启闭控制,自动采集与监视弧形工作门启闭过程中各种工况参数,并且具有故障报警和事故处理等功能。     

粘质沙雷氏菌膜结合葡萄糖酸脱氢酶的分离纯化及其酶学特性

经超声破碎细胞、TritonX-114相分离、盐析、DEAE-sepharose离子交换层析和Hydroxyapatite吸附层析等步骤,从2-酮基葡萄糖酸(2-keogluconic acid,2KGA)生产菌株粘质沙雷氏菌JUIM03中获得比活力91.43 U/mg、纯化倍数160.4倍的膜结合葡萄糖酸脱氢酶(gluconate dehydrogenase,GADH)。研究结果表明,粘质沙雷氏菌膜结合GADH由3个亚基组成,其分子质量分别为65.0、45.0 kDa和23.0 kDa左右,是一种含有细胞色素C的黄素蛋白,能够催化氧化葡萄糖酸为2KGA。粘质沙雷氏菌膜结合GADH的最适反应温度为40℃,最适反应pH 5.0,在30℃以下、pH 5.0～6.0的条件下较为稳定;该酶具有严格的底物特异性,只有在D-葡萄糖酸作为底物时才具有催化活性,其Km值为1.33 mmol/L;一些金属离子(如Fe~(3+)、Cu~(2+)和Zn~(2+))、有机溶剂(乙醇、异丙醇、甲醇和丙酮)、变性剂(十二烷基硫酸钠和巯基乙醇)以及有机酸(草氨酸和草酸)对膜结合GADH的催化活性具有明显的抑制作用。研究为粘质沙雷氏菌2KGA生物合成的过程优化与控制提供了一定的理论依据。     

微生物发酵粗甘油生成1,3-丙二醇的研究进展

粗甘油是生物柴油生产中的一个主要副产物,而通过微生物可将粗甘油转化为高附加值的1,3-丙二醇。1,3-丙二醇在食品、化工、医药、化妆品等很多领域具有非常广泛的应用。本文从1,3-丙二醇的粗甘油生物转化的迫切性、生产的菌种、合成的途径、合成的基因、发酵转化以及生产中的问题与策略等方面综述了微生物发酵粗甘油生成1,3-丙二醇的最新研究进展。