重组大肠杆菌全细胞转化马来酸高效合成富马酸

重组Escherichia coli细胞催化马来酸合成富马酸时,细胞中富马酸酶将产物富马酸转化成苹果酸,转化率达15.5%,降低了富马酸的转化率和纯度。将E.coli BL21(DE3)基因组中fum A-fum C基因敲除,并高效表达马来酸顺反异构酶,重组菌BL21(DE3)△fum A-fum C/p ET24a-mai A经发酵罐培养,可产生64 g/L菌体,马来酸顺反异构酶表达量达306 U/m L。按照60 g/L的发酵液:2 mol/L富马酸为1∶4的体积比配置反应液,37℃反应1 h,富马酸转化率高达98.4%,仅产生0.7%的苹果酸副产物。该结果为全细胞催化法合成富马酸的工业化奠定了基础。     

介导纳豆激酶分泌表达的信号肽比较

以纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)的基因组为模板,PCR分别扩增编码信号肽、前导肽、成熟肽的前纳豆激酶原基因序列(pre-pro-nk),编码前导肽、成熟肽的纳豆激酶原基因(pro-nk),构建了含有三种不同信号肽的纳豆激酶重组质粒pMA0911-wapA-pro-nk、pMA0911-yncM-pro-nk、pMA0911-pre-pro-nk(m)。通过3种信号肽介导的纳豆激酶的分泌表达、酶活性质分析等实验结果表明,wapA信号肽介导的纳豆激酶的分泌效率以及纤溶酶活性最高。对wapA信号肽介导的纳豆激酶表达产物进行了纯化,纯化倍数及回收率分别为2.15和21.5%。酶学性质分析结果表明重组纳豆激酶的最适温度、最适pH分别为50℃和pH 8.0,纳豆激酶在温度低于60℃及pH 5.0~11.0比较稳定。本研究为纳豆激酶的基因工程改造以及进一步提高纳豆激酶在枯草芽孢杆菌中的表达量奠定了一定的基础。     

即墨黄酒煮糜工艺对挥发性物质的影响

采用溶剂辅助风味蒸发(solvent assisted flavor evaporation,SAFE)和顶空固相微萃取法(headspace solid-phase microextraction arrow,HS-SPME-ARROW)结合全二维气相色谱-飞行时间质谱技术(comprehensive two dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometry,GC×GC-TOFMS)对即墨黄酒煮糜前后样品的挥发性化合物进行鉴定与分析。采用2种前处理方法分别在煮糜前后的样品中鉴定出86和403种挥发性组分。煮糜前样品的挥发性化合物以醛类、酮类、醇类和酯类化合物为主,分别检测到37、20、14种;而煮糜后的样品以含氮化合物、醛类、酮类、呋喃类以及吡喃类物质为主,分别检测到77、66、53种。经过煮糜工艺后具有焦香、烘烤香的含氮化合物、呋喃类、吡喃类物质的数量大幅增加,这些物质可能对即墨黄酒的焦香有重要贡献。该研究通过探讨了煮糜工艺对挥发性化合物的影响,为进一步研究即墨黄酒的风味特征提供了理论依据。     

搅拌桨组合数值模拟优化及在谷氨酰胺转胺酶发酵中的应用

搅拌是影响发酵过程的主要因素之一,组合不同类型搅拌桨、发挥其各自优势,势必能够优化搅拌性能、提高微生物发酵生产效率。本研究采用计算流体力学(CFD)方法,模拟六直叶涡轮桨(DT)和DT、DT和抛物线桨(BT6)、六斜叶桨(CM6)和DT以及CM6和BT6四种搅拌桨组合对流场和混合时间的影响。对模拟得到的混合时间进行实验验证。结果表明,最优组合为:上桨叶为CM6桨,下桨叶为BT6桨。吸水链霉菌WSH03-13产谷氨酰胺转胺酶(TG)的发酵实验结果表明:CM6和BT6桨组合可获得最高的谷氨酰胺转胺酶活性和生物量,分别为4.7U/mL和42.9g/L,较优化前(DT和DT桨)分别提高了53%和40.9%,说明优化后的搅拌桨组合更有利于微生物生长和发酵。研究结果为组合搅拌桨在微生物发酵过程中的应用提供了借鉴。     

基于代谢工程策略合成L-苹果酸研究进展

L-苹果酸在食品、医药、化工等领域被广泛应用。工业上以石油基原料为底物,通过化学法或酶法合成L-苹果酸。随着石油资源的日渐短缺,利用可再生资源以生物法合成L-苹果酸受到人们的重视。近年来应用代谢工程策略改造大肠杆菌、酵母菌等菌株,进行L-苹果酸的合成,具有一定应用前景。同时,应用合成代谢工程在体外构建代谢途径进行L-苹果酸合成,具有较高的理论价值。本文首先总结了L-苹果酸合成的代谢途径;其次对L-苹果酸合成的代谢工程策略进行了综述,包括强化L-苹果酸合成代谢途径、删除副产物合成途径、促进还原力再生,以期较为系统地阐述L-苹果酸代谢机制的研究现状;最后对L-苹果酸代谢工程的研究方向进行了展望。     

固定化苯丙氨酸脱氨酶拆分D,L苯丙氨酸制备D苯丙氨酸

为了建立新的D-苯丙氨酸生产工艺,对固定化苯丙氨酸解氨酶(PAL)拆分D,L-苯丙氨酸进行了研究。以介孔材料(MCM-41)为载体固定PAL,将其用于拆分消旋体D,L-苯丙氨酸制备高光学纯的D-苯丙氨酸。最佳的固定化条件是载酶量为50mg/g、壳聚糖浓度为0.1%(w/v)、戊二醛浓度为0.05%(v/v),固定化酶的活性达到最大,酶活保留达到92%,重复利用20次后,活性仍能保持85%。将制备的固定化酶应用于D,L-苯丙氨酸的拆分,反应24h L-苯丙氨酸转化率达到98%,D-苯丙氨酸的ee值达到96%,且连续拆分10个批次后固定化酶对L-苯丙氨酸的转化率仍保持在95%以上。因此,高效稳定的固定化PAL在拆分D,L-苯丙氨酸生产D-苯丙氨酸中具有良好的应用前景。     

通过定点突变增强纳豆激酶的热稳定性

血栓导致的心脑血管疾病是当前危害人类健康、导致死亡率最高疾病之一,因此近年来溶栓药物及具有溶栓功能保健食品的研发进展得十分迅速。纳豆激酶因其特有的高效溶血栓作用,成为国内外科研热点之一。本研究针对目前纳豆激酶稳定性的问题,以纳豆激酶的晶体结构和序列比对为基础,通过定点突变构建组纳豆激酶突变体,对可能影响纳豆激酶热稳定性的氨基酸进行研究。在构建的5个突变体中,P14L、N76D两个突变体的热稳定性有明显提高,在65℃下的半衰期由20 min分别提高为30 min和50 min。同源建模和分子动力学研究结果表明,这两个氨基酸位点是通过不同机理对纳豆激酶催化活性以及热稳定性产生的重要作用。本研究可为纳豆激酶的基因工程改造以及其生产和应用提供理论基础和技术支持。     

粘质沙雷氏菌马来酸顺反异构酶表达纯化及酶学性质

从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)中扩增得到马来酸顺反异构酶基因。将该基因连接到p ET24a载体上,并在Escherichia coli BL21(DE3)中实现了成功表达。酶学性质研究表明,重组酶的比酶活力为48.01 U/mg。其最适温度为37℃,最适p H为8.4。在最适反应条件下,Km值为4.20 mmol/L,Vmax为1.27 mmol/(L·min),kcat为4.38 s-1,催化效率kcat/Km为1.04 L/(mmol·s)。研究结果进一步显示,马来酸顺反异构酶具备良好的热稳定性(55℃半衰期为1.5 h)及高达99%以上的转化率,为马来酸顺反异构酶的进一步研究和工业应用制备高纯度的富马酸提供了理论基础和支持。     

牛樟芝液体发酵过程挥发性物质分析

目的:分析牛樟芝发酵液中挥发性物质在液体发酵过程中的动态变化并以此为依据进行统计分析。方法:采用顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱技术对挥发性物质进行定性定量分析,并利用主成分分析和聚类分析对牛樟芝进行综合评价。结果:牛樟芝液体发酵过程中,不同阶段呈现出不同的香味,此过程共鉴定出50种化合物,其中醇类10种,酯类16种。主成分分析结果表明,主成分1和主成分2的方差贡献率为62.786%,能够代表牛樟芝的主要挥发性物质;聚类分析结果表明,整个发酵过程随挥发性物质变化规律聚集为3类。结论:牛樟芝液体发酵过程产生的香味物质可以作为化妆品、食品等领域的重要天然资源,同时,挥发性物质的综合分析为将来对牛樟芝相关产品的质量评价、价值评估以及新产品开发提供了重要的技术指标。     

高分子量腈水合酶工程菌生产烟酰胺的工艺建立

为提高表达玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous J1)来源的高分子量腈水合酶大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET-24a(+)-nhh Brbs Arbs G(BAG)的菌体酶活,建立了合适的烟腈全细胞催化工艺以及重组工程菌的高密度发酵工艺。采用正交试验L_9(3~4)对摇瓶培养基中各组分进行优化,比较烟腈底物流加和底物分批补料工艺,对重组菌进行分批补料高密度发酵培养。培养基优化后其菌体生物量提高到4.42 gDCW/L,细胞比酶活提高到30.91 U/mgDCW;与烟腈底物流加相比,烟腈分批补料工艺更适合烟酰胺的生产,通过此工艺的反应,摇瓶发酵后的BAG能够生产390 g/L烟酰胺;对BAG进行5 L发酵罐分批补料扩大培养,菌体生物量最高达到73.97 gDCW/L(OD600=200),细胞比酶活最高为42.70 U/mgDCW,单位发酵液酶活最高为2 813 U/mL,用较高密度的发酵罐培养后重组菌进行烟腈催化反应,产物质量浓度能达到537 g/L,是已报道的大肠杆菌重组表达腈水合酶产烟酰胺所得终质量浓度的最高水平。