基于识别重叠序列特性的限制性内切酶的重组表达策略研究

甲基转移酶可以保护宿主基因组DNA免受限制性内切酶的消化，根据这一特性，经典的限制性内切酶制备策略是首先通过表达与其配对的甲基转移酶来保护宿主菌株，然后再共表达限制性内切酶，即“一对一”的重组表达模式。作者设计了一个新的策略：通过共表达识别重叠序列的甲基转移酶来保护宿主菌株，以制备限制性内切酶。首先将识别重叠序列的甲基转移酶转入大肠杆菌ER2566，以保护宿主基因组DNA，然后将能识别重叠序列的多个限制性内切酶分别转入该宿主菌株，以进行限制性内切酶的重组表达，即“一对多”的重组表达模式。根据这一方法，利用甲基转移酶M. EsaDix5 I、M. Alu I和M. Hha I实现了识别重叠序列(TTAA、AGCT和GCGC)的一系列限制性内切酶的重组表达，还利用甲基转移酶M. Alu I成功实现了两个新的R. Sac I同裂酶R. EcoSP4ORF25090P和R. Gma5ORF28P的重组表达。该方法简化了对抵抗限制性内切酶消化的宿主菌株的大量筛选工作，并提供了大规模制备限制性内切酶的能力。这一方法也可用于发现其他微生物中新的同工酶或同裂酶。     

灵杆菌胞外核酸酶在短短芽孢杆菌中的高效表达

利用短短芽孢杆菌（Brevibacillus choshinensis）原核表达系统对灵杆菌胞外核酸酶（Serratia marcescens non-specific nuclease，SMNE）进行重组表达，以期获得高产量重组SMNE。利用大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体构建SMNE重组质粒，实现其在B. choshinensis HD31-SP3菌株中的表达。通过粗酶活检测验证其活性后，首先对温度、甘油和发酵时长等发酵条件进行优化，随后将获得的重组SMNE经亲和层析、凝胶阻滞层析分离纯化后进行酶活性质表征检测。经B. choshinensis HD31-SP3菌株重组表达的SMNE，初测胞外酶活为4.07×10⁶ U/L。经发酵条件的优化测试，最终在培养基中加入终体积分数5%甘油，于30 ℃下摇瓶培养56 h，获得的发酵上清胞外酶活可达2.6×10⁷ U/L，是未优化条件的6倍；经蛋白质纯化条件筛选，最终经一步亲和纯化后SMNE回收产量即达30~40 mg/dL，比活力为1.3×107 U/mg，为商业化对照的2~3倍。通过对该酶的酶学性质鉴定后发现：该酶最适反应条件为37~45 ℃，pH 8~9；在不存在Mg²⁺/Mn²⁺的情况下仍保持47%的活性，且在300 mmol/L Na+/K+条件下可保持35%~45%的活性。