鲢鱼和草鱼下脚料中CPIs抑制活性比较及其分子量分布的鉴定

本研究首先确定偶氮酪蛋白（Azocasein）法和荧光合成肽法测定CPIs抑制活性的适宜反应体系,并证实Azocasein法更适合在鲢、草鱼下脚料（卵、皮）粗提过程中监测CPIs的抑制活性,而在层析过程中需采用高灵敏度的荧光合成肽法。Azocasein法测定表明,草鱼卵（349600units、332units/mg）和皮（25600units、87units/mg）中总活和比活均分别显著高于鲢鱼卵（10620units、3.98units/mg）和皮（3726units、14.14units/mg）;同时,草鱼卵中CPIs抑制总活、比活均高于皮;鲢鱼卵中CPIs抑制总活高于皮,但抑制比活则低于皮;此外,根据Sephacryl S-200分子筛层析中活性峰位置,初步判断两种鱼卵和皮组织中均存在高（50¹28ku）、低（7¹9ku）分子量形式的CPIs,但明胶底物-SDS-PAGE反相酶谱中仅可见高分子CPIs形成的条带,而小于20ku的低分子CPIs均无法得到鉴定。      

鲢鱼肝脏中高分子CPIs提取方法的建立及其鉴定

研究了不同浓度的丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF)、热处理条件及pH值对鲢鱼肝脏中高分子半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine proteinase inhibitors,CPIs)提取过程中的作用,根据其对CPIs在TSK液相上高分子质量部分的蛋白峰值和比活力(荧光合成肽底物法)的影响,确定了最佳粗提条件为:以含5 mmol/L的苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF),100mmol/L的Tris,3 mmol/L的EDTA(pH 7.5)作为提取缓冲液,而后在pH 8.7碱处理条件下经90℃加热5 min后,再回调到pH 7.0。用该法制备的鲢鱼肝脏CPIs粗提物经制备型Sephacryl S-200分子筛层析,分离得到的高分子活性部分,进一步经过反相酶谱法鉴定得到一种高相对分子质量的活性CPI,推测其可能是与某些蛋白结合形成了复合物,或是高分子CPIs的二聚体形式。     

鲢鱼卵中低分子CPIs的纯化鉴定及改善鱼糜凝胶强度的效果研究

通过比较鲢鱼卵半胱氨酸蛋白酶抑制因子（cysteine proteinase inhibitors,CPIs）粗提过程中的比活力（Azocasein法）,确定其最佳粗提条件为：以含0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF）的20 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.0）作为匀浆缓冲液,并于30 ℃对匀浆样进行pH 3.0酸处理10 min,然后碱回调至pH 8.0,CPIs纯度提高了15.54 倍。进一步经SP Sepharose Fast Flow阳离子层析验证表明,与pH 4.0相比,pH 3.0酸处理能高效除去活性峰Ⅱ中的酸碱及热不稳定杂蛋白,使CPIs比活力提高了48.22 倍。采用SephacrylS-200分子筛层析,获得部分纯化的低分子CPIs组分Ⅱ-b和Ⅱ-c,比活力和纯化倍数分别为1 098.59 U/mg、312.10 倍和1 769.23 U/mg、502.62 倍。电泳分析表明,明胶底物-SDS-反相酶谱法无法鉴定Ⅱ-b和Ⅱ-c的抑制活性;而与木瓜蛋白酶在适宜条件下反应后进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）则初步鉴定Ⅱ-b和Ⅱ-c中均含有至少7 kD和10 kD两种低分子CPIs。最后经质构分析表明,Ⅱ-b和Ⅱ-c以5 U/g添加入鲢鱼鱼糜时,均能够极显著提高鲢鱼鱼糜凝胶强度（48.77%和55.55%）,抑制软化。     

鲢鱼重组Cystatin的原核表达、鉴定及对铜绿假单胞菌的抑制作用

本实验主要对鲢鱼半胱氨酸蛋白酶抑制因子Cystatin进行原核表达和纯化鉴定,并研究重组Cystatin对铜绿假单胞菌的抑菌效果。首先用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导转入pET-30-Cystatin的E.coli BL21（DE3）表达重组Cystatin蛋白,经Ni2+-NTA镍离子亲和层析对其进行纯化,该重组蛋白在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示单一条带,分子质量约20.6 kD,在TSK-GEL G2000SW凝胶过滤高效液相色谱上呈单一活性峰,纯度为94.27%,经标准曲线计算其分子质量为20.9 kD;其次,利用抑制剂滴定曲线法,以偶氮酪蛋白为底物,确定重组Cystatin对木瓜蛋白酶（45.375 μmol）的一个抑制活性单位为0.718 μg;最后通过滤纸片扩散法鉴定鲢鱼重组Cystatin对铜绿假单胞菌的抑菌效果,结果表明Cystatin的添加量为20、60、120、200 U/片时,抑菌圈直径分别为8、9、13、26 mm。鲢鱼重组Cystatin对铜绿假单胞菌的抑菌效果呈剂量依赖关系。     

外源脂肪酶改善腊鱼品质

该研究以鲢鱼为主要原料,植物乳杆菌、木糖葡萄球菌和酿酒酵母为混合发酵剂,发酵期间加入外源脂肪酶制作腊鱼产品。通过分析腊鱼的游离脂肪酸、pH值、白度、质构,以及结合感官评价结果探究发酵温度、脂肪酶添加量和添加时间对腊鱼品质的影响。结果表明,脂肪酶可有效改善腊鱼的品质。具体方法为:鲢鱼块接入发酵剂在20℃下发酵27 h后,加入0.04%(以鱼肉计)的外源脂肪酶(22000 U),继续在20℃下发酵45 h,然后经冲洗、烘干(30℃,3 h)、成熟(15℃,5 d)得到最终产品。与未加酶产品相比,加酶后发酵腊鱼的游离脂肪酸、pH发生较大改变,产品的色、香、味均有明显改善,说明外源脂肪酶可通过影响腊鱼在发酵过程中的脂肪代谢达到提升产品品质的目的。     

鲢鱼卵高分子质量CPI-I 的纯化与鉴定

以鲢鱼卵为材料制备半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CPIs)的粗提浓缩液,进而经Q Sepharose Fast Flow阴离子层析和Sephacryl S-200分子筛层析,获得部分纯化了的CPI-I。以偶氮酪蛋白(azocasein)法监测粗提液及层析纯化中CPIs的抑制活性。层析过程中,以灵敏度更高的荧光合成肽底物(Z-Phe-Arg-MCA)法监测洗脱物的CPIs抑制活性的热稳定性。最终鲢鱼卵CPI-I被纯化了72倍,酶回收率为10.25%。利用Sephacryl S-200分子筛层析Marker标准曲线以及反相酶谱法,初步判断CPI-I的分子质量为89kD。高碘酸-Schiff试剂(PAS)染色法证明该蛋白为糖蛋白。CPI-I能够抑制鲢鱼组织蛋白酶L,且具有显著的热稳定性。     

卷丹百合提取物对4℃有氧冷藏草鱼肉片中优势腐败菌的抑菌效果

首先采用传统的分离方法从4℃有氧冷藏草鱼去皮肉片货架期终点中分离出3株优势菌株,并对其进行鉴定。随后将这3株优势菌分别回接到4℃有氧冷藏草鱼肉片上,判断其致腐能力。最后,采用滤纸片法测定卷丹百合(Lilium lancifolium Thunb.)花叶、花蕾提取物对3株优势腐败菌的抑菌活性。结果表明,4℃有氧冷藏草鱼去皮肉片货架期终点优势腐败菌为腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)、草莓假单胞菌(Pseudomonas fragi)和中间气单胞菌(Aeromonas media),其中腐败希瓦氏菌的致腐能力最强。抑菌实验表明,当加量为20μL时,卷丹百合花叶水提物对腐败希瓦氏菌的抑菌圈直径为32 mm,花蕾60%乙醇提取物对草莓假单胞菌和中间气单胞菌的抑菌圈直径分别达到10 mm和26 mm。因此,可以判断卷丹百合提取物对4℃有氧冷藏草鱼去皮肉片中货架期终点优势腐败菌具有抑菌效果。     

SNS主动防护网在国道307线坡头段改线中的应用

通过分析国道307线坡头段改线工程的地质情况,采用SNS主动柔性防护网进行坡面防护,阐述了SNS主动柔性防护网的防护原理以及安装工序,实施效果表明:SNS主动防护网是一种新型环保、安全经济的坡面防护形式。     

小学数学教学的生活化

数学教学要源于现实、扎根于现实。生活中有数学,数学中有生活。数学教学要把生活情境引入课堂,给孩子们一双“生活的眼睛”,让学生感到数学有趣、数学有理、数学有用。为此,课堂要向生活开放延伸;用生活情境激发学生学习数学的兴趣;引导学生用“生活的眼睛”去解决数学问题;还要用作业的触角,帮助学生捕捉生活中的数学信息。     

建鲤组织蛋白酶L的克隆表达、纯化及活性特征鉴定

首先采用TA克隆技术克隆建鲤组织蛋白酶L（Cathepsin L,CAT L）成熟肽基因片段并进行双酶切鉴定,进而构建表达载体CAT L-p ET-30a并转入宿主菌E.coli BL21,经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）在37℃诱导2 h表达重组CAT L蛋白。而后经尿素梯度洗涤和镍离子亲和层析纯化目的蛋白,并利用SDS-PAGE检测诱导效果和纯化过程。最后以荧光合成肽底物（Z-Phe-Arg-MCA）测活法鉴定建鲤重组CAT L的热稳定性、p H稳定性,以及鱼糜生产和冻藏中常用添加剂对其活性稳定性的影响。双酶切鉴定结果表明成功克隆了目的基因片段,与鲤鱼CAT L基因序列相似性为99.11%。SDS-PAGE分析表明经诱导、尿素梯度洗涤及亲和层析后,成功获得高度纯化目的蛋白,分子量约28 ku。活性鉴定结果表明重组CAT L在20⁵0℃及p H3.0⁶.5范围内稳定;氯化钠、焦磷酸钠对重组CAT L活性的抑制作用呈现剂量依赖关系,而各浓度蔗糖、山梨醇则对其活性无明显作用。本研究成功克隆、表达和纯化了建鲤CAT L,并阐明了热、p H及鱼糜生产和冻藏中常用添加剂对该酶稳定性的不同影响。