灵杆菌胞外核酸酶在短短芽孢杆菌中的高效表达

利用短短芽孢杆菌（Brevibacillus choshinensis）原核表达系统对灵杆菌胞外核酸酶（Serratia marcescens non-specific nuclease，SMNE）进行重组表达，以期获得高产量重组SMNE。利用大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体构建SMNE重组质粒，实现其在B. choshinensis HD31-SP3菌株中的表达。通过粗酶活检测验证其活性后，首先对温度、甘油和发酵时长等发酵条件进行优化，随后将获得的重组SMNE经亲和层析、凝胶阻滞层析分离纯化后进行酶活性质表征检测。经B. choshinensis HD31-SP3菌株重组表达的SMNE，初测胞外酶活为4.07×10⁶ U/L。经发酵条件的优化测试，最终在培养基中加入终体积分数5%甘油，于30 ℃下摇瓶培养56 h，获得的发酵上清胞外酶活可达2.6×10⁷ U/L，是未优化条件的6倍；经蛋白质纯化条件筛选，最终经一步亲和纯化后SMNE回收产量即达30~40 mg/dL，比活力为1.3×107 U/mg，为商业化对照的2~3倍。通过对该酶的酶学性质鉴定后发现：该酶最适反应条件为37~45 ℃，pH 8~9；在不存在Mg²⁺/Mn²⁺的情况下仍保持47%的活性，且在300 mmol/L Na+/K+条件下可保持35%~45%的活性。