PARP-1体外活性测定方法的建立及其应用

建立PARP-1的体外活性测定方法并对84个具有潜在PARP抑制活性的化合物进行筛选。从Sf9昆虫细胞中提取酶液,以NAD+为底物,DNA为激活剂,建立PARP-1的活性测定方法;以高通量技术参数评价此方法,用已知PARP抑制剂进行验证,并以此方法进行PARP抑制剂的筛选。结果显示,确定的酶促反应体系为:12.5 nmol/L NAD+,15μg/m L DNA,6.25×10-4U PARP-1。评价Z'因子为0.76,S/B值为3.58。基于此模型筛出47个化合物在浓度7.4μmol/L时对PARP-1的抑制率达到60%以上。表明所建立的PARP-1活性测定方法,适用于PARP-1抑制剂的高通量筛选。     

CHO细胞Kcmf1基因内定点整合ZsGreen1报告基因的表达稳定性研究

以Kcmf1基因NW_003614172.1第629890碱基处定点整合ZsGreen1报告基因的CHO-K1细胞(2C3)为研究材料,采用倒置荧光显微镜和流式细胞仪定量分析ZsGreen1的表达,开展系统的稳定性表达研究。2C3细胞贴壁培养连续传代50代次,100%的细胞可以稳定表达ZsGreen1报告基因。无血清悬浮驯化培养2C3细胞后,细胞表达ZsGreen1的平均荧光强度明显降低;连续悬浮传代培养60代次,表达ZsGreen1的细胞数目显著增多,添加体积分数10%FBS到悬浮培养的细胞池,ZsGreen1阳性细胞比例上升到95%以上。流式细胞术分选细胞池中高、低表达ZsGreen1蛋白的2C3细胞,PCR确认它们均含有ZsGreen1报告基因;Q-PCR发现在高、低表达ZsGreen1蛋白的细胞中,相关的ZsGreen1 mRNA水平有明显的差异。提示CHO-K1细胞Kcmf1基因内非编码区域定点整合外源基因后,不会因细胞分裂和生长而丢失外源表达基因;悬浮驯化需要优化培养基和培育条件,达到构建工程细胞的需求。