根瘤菌多糖的发酵优化及抗肿瘤活性

优化根瘤菌(Rhizobium NG10)产多糖的培养条件,提高胞外多糖(extracelluar polysaccharides of Rhizobium,REPS)产量,并探究其抗肿瘤活性。通过单因素实验、Plackett-Burman实验和Box-Behnken实验等对根瘤菌产胞外多糖发酵培养基配方进行优化,并采用MTT法检测多糖对人肝癌细胞的抑制作用。最终优化得到的最优培养基配方为:麦芽糖22. 5 g/L,大豆蛋白胨9. 5 g/L,Mg SO4·7H2O 0. 2 g/L,KH2PO40. 41 g/L,Na Cl 0. 1 g/L,此时胞外多糖产量为5. 05 g/L,相比原始提高了45. 95%; REPS对肝癌细胞Hep G2的抑制呈一定的量效关系,培养时间为48 h时IC50为393. 3μg/m L,肝癌细胞抑制率达到56. 74%。     

超声纳滤及多酶水解集成制备酵母高F值寡肽

构建一种根据原料特点步步可控且有放大前景的集成工艺路线制备高F值酵母寡肽。以活性干酵母为初始原料,超声破碎匀浆后从几种常见蛋白酶中筛选出酵母抽提酶;利用纳滤浓缩粗肽并去除其中少量游离氨基酸,最后采用α-胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A双酶依次定向酶解,使酵母粗肽中的多肽不仅能水解为分子量更小的寡肽且能使肽中的芳香族氨基酸大量游离出来,而通过选择性吸附除去游离的芳香族氨基酸而获得高F值寡肽。结果表明:碱性蛋白酶作为酵母抽提酶来获取酵母蛋白,抽提酵母细胞条件为料液比1∶6、温度50℃、加酶量1000 U·g-1干酵母、p H8.0、酶解时间6 h;纳滤操作条件为采用500 Da纳滤膜在0.3 MPa下浓缩液体积降为原来的1/3;对α-胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A这两种酶进行单因素实验,获得α-胰凝乳蛋白酶最佳酶解条件:加酶量6000 U·g-1酵母粗肽、温度40℃、pH8.0、时间4 h;羧肽酶A最佳酶解条件:加酶量4 U·m L-1酵母粗肽、温度40℃、酶解p H7.5、时间4 h;活性炭吸附脱芳条件:吸附时间2 h,吸附温度30℃,吸附pH2.5,吸附炭液比1∶10。在此集成工艺下成功获得了数批F值在30～40的高F值酵母寡肽产品,证明此集成工艺能够高效稳定制备高F值酵母寡肽,对于工业化生产具有一定的指导意义。     

近10年我国传统饮料酒白酒和黄酒品质安全研究现状与展望

总体上说,我国白酒和黄酒的安全性指标研究起步较晚,特别是白酒和黄酒中氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate, EC)的研究,大部分研究更多关注检测方法的开发,针对可能超过限量的指标的消减技术研究较少,而从源头和过程控制角度进行消减的技术研究显得更为稀少。建议尽快制订相关标准和/或控制指南,加大基础性研究和控制技术研究力度,为我国白酒和黄酒品质安全研究提出建设性建议。本文重点回顾了近10年来我国传统饮料酒白酒、黄酒中氨基甲酸乙酯、氰化物、生物胺、真菌毒素和塑化剂等安全风险因子的研究现状,包括检测方法、产品现状、过程变化、产生机制或形成途径,以及消减技术,对现有饮料酒白酒和黄酒品质安全研究的问题与挑战进行了分析。     

热带假丝酵母磷酸甘油酸激酶基因启动子功能鉴定

热带假丝酵母是重要的工业生产菌株,但表达系统还不完善导致代谢工程育种手段受到限制。探索新的表达元件对热带假丝酵母的基因工程育种十分重要。本文通过多重序列比对从热带假丝酵母ATCC 20336基因组中扩增得到一个具有较高活性的磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子,以酵母增强型绿色荧光蛋白(yeGFP3)作为报告基因,整合到热带假丝酵母基因组上并对其表达活性进行研究。通过分离300、550、750 bp和846 bp4个长度的启动子片段分别表达yeGFP3,转化XZX宿主菌获得P-1、P-2、P-3和P-4共4个转化子。荧光显微镜结果表明,随着启动子长度的截短,荧光逐渐减弱,前3个转化子的相对荧光强度分别为P-4的4.98%、9.84%和48.4%。同时分析了4个转化子的yeGFP3转录水平,转录水平分别为P-4的5.6%、13.8%和60%。初步判断PGK1启动子至少存在2个上游激活序列(UAS)。     

调控乙酰CoA合成酶表达促进乙酸利用及GlcNAc合成

N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)是一种重要的功能单糖。在利用枯草芽孢杆菌发酵产GlcNAc的过程中,乙酸的积累严重抑制了细胞生长和GlcNAc合成。为了获得高效利用乙酸生产GlcNAc的微生物细胞工厂,作者通过突变乙酰CoA(Ac-CoA)合成酶编码基因acsA 5′UTR区域内全局转录调控因子CodY结合序列,调控acsA转录水平,进一步突变AcsA乙酰化调控位点,解除乙酰化修饰,促进乙酸转化为Ac-CoA,最终乙酸积累量由6.3 g/L减少到3.6 g/L,同时细胞干重(DCW)由2.7 g/L增加到5.3 g/L,GlcNAc产量由1.9 g/L提高到5.0 g/L,为进一步获得高产GlcNAc细胞工厂提供了基础。     

Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中分泌途径的鉴定及其分泌能力的提高

食品安全（GRAS）菌株枯草芽孢杆菌由于其具有良好的分泌表达能力及易于基因工程操作等特性被广泛用作外源蛋白质的表达菌株。枯草芽孢杆菌中蛋白质的分泌大多依赖于信号肽介导的Sec分泌途径（General secretion pathway）和Tat分泌途径（Twin-arginine translocation pathway）。在本研究中，通过信号肽预测、蛋白质N端测序等手段发现来自于Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌并不依赖信号肽，该酶通过非经典蛋白质分泌途径（non-classical protein secretion pathway）进行分泌。通过信号肽筛选，发现最适合该酶在枯草芽孢杆菌中表达的信号肽为Tat分泌途径信号肽SP_phoD，并通过共表达分子伴侣PrsA的方式将该L-天冬酰胺酶的分泌量提高了72.11%。     

耐盐性谷氨酰胺酶在Bacillus subtilis 168中的整合表达

微生物质粒过表达外源基因,会由于质粒分离稳定性低、种子培养基中需添加抗生素等原因,限制其在工业生产中的应用。为了得到一株可用于工业生产谷氨酰胺酶的菌株,选择食品安全级Bacillus subtilis 168作为宿主,将来源于Micrococcus luteus K-3的编码耐高浓度盐的谷氨酰胺酶基因(Mglu)插入到其染色体上进行整合表达。选择了2个内源性蛋白酶基因作为整合表达位点,通过lox序列的重组消除抗性基因,得到无抗性基因的重组谷氨酰胺酶表达菌株。遗传稳定性研究表明,在不添加抗生素的条件下,通过连续传代重组菌株并测定发酵酶活,发现重组菌株连续传42代时,酶活基本不变。随后,采用5 L发酵罐对重组菌株进行分批补料发酵,最高酶活达到了41.5 U/mL。本研究对提高谷氨酰胺酶重组菌株遗传稳定性提供了借鉴。     

甘油预处理蔗渣的木质素分离提取及结构表征

以甘油分别对甘蔗渣进行常压甘油自催化（AGO）预处理和常压甘油碱催化（al-AGO）预处理。利用酸沉法分别从预处理液中得到自催化甘油木质素（AGOL）和碱催化甘油木质素（al-AGOL）。利用单因素实验和正交实验得到最佳木质素提取工艺为转速8000r/min、离心时间15min、甘油混合液pH为3、甘油混合液浓度10%，在该条件下木质素AGOL和al-AGOL提取率分别达到72%和76%。采用扫描电镜（SEM）、元素分析、紫外光谱（UV）、凝胶色谱（GPC）、核磁共振¹H谱、热重分析以及抗氧化活性分析等技术手段对提取得到的木质素进行结构表征。结果表明：从甘蔗渣中提取的球磨甘蔗木质素（MBL）、AGOL和al-AGOL主要呈现出球形特征；AGOL和al-AGOL具有相似的活性特点，与MBL相比，AGOL和al-AGOL的分子量更小、分布更窄、均一性更好，热稳定性和抗氧化活性更高，有望成为重要的工业原料。     

定点突变提高食品新型L-天冬酰胺酶的活力及热稳定性

L-天冬酰胺酶（L-asparaginase II，EC 3.5.1.1）可将L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸，减少高温加工食品中丙烯酰胺的形成，因而受到人们的广泛关注。该酶在食品加工及预处理阶段的使用已受到人们广泛的关注，但是由于食品加工及预处理过程中环境的复杂性，对L-天冬酰胺酶的性质、热稳定性和酶活等方面有较高的要求。通过序列对比和同源模拟对嗜热菌Pyrococcus yayanosii CH1来源的编码L-天冬酰胺酶的基因PyAsnase进行了3个位点的突变，并在Bacilus subtilis 168 中进行表达，提高了该酶的热稳定性及比酶活。其中突变株E22K较原始菌株相比所得突变体比酶活提高了约37.3%，突变株R111L较原始菌株相比所得突变体的比酶活提高了约31.1%，突变株M92A较原始突变菌株相比所得突变体在85 ℃时的半衰期延长了约30 min。本研究结果为探索L-天冬酰胺酶结构和功能的相互关系提供了借鉴，提高了其在食品工业中的应用前景。     

抑制呕吐毒素生物合成的乳酸菌的筛选及鉴定

以禾谷镰刀菌ACCC36938为指示菌,测定不同乳酸菌对其抑制作用,筛选得到抑菌效果较强的1株乳酸菌A14-2。进一步研究不同温度、p H值和蛋白酶处理对乳酸菌A14-2抑菌活性的影响,结果表明p H值变化对其影响最大,同时也存在非蛋白类热敏感物质具有一定抑菌作用。为了探究乳酸菌A14-2对禾谷镰刀呕吐毒素(deoxynivalenol,DON)生物合成的影响,选用麦芽汁作为培养基,将乳酸菌和禾谷镰刀菌混合在麦芽汁培养基中共同培养,分析培养基中DON质量浓度变化,结果发现乳酸菌培养物及其上清液均能够在抑制禾谷镰刀菌生长的同时,也显著降低了DON的合成量,但乳酸菌细胞对DON无吸附作用。最后对乳酸菌A14-2进行理化及分子鉴定,显示其为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。