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1.
采用PCR技术以E.coliK-12基因组DNA为模板扩增出γ-谷氨酰转肽酶基因,克隆至原核表达载体pET28(a)和pET32(a)中,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),借助SDS-PAGE分析方法,对于用乳糖诱导,由T7 lac启动子控制的重组目的产物蛋白的表达规律进行了优化研究.在对诱导条件进行优化控制的前提下,分析比较了乳糖诱导pET28(a)/]-ggt和pET32(a)/γ-ggt两种重组质粒表达大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶蛋白的可溶性及酶活.实验结果表明,对于T7lac启动子控制的重组目的产物,乳糖作为诱导剂也可以起到很好的诱导表达效果,低温培养下,乳糖诱导pET32(a)/γ-ggt重组质粒表达γ-谷氨酰转肽酶具有更高的蛋白可溶性和酶活. 杆茵BL21(DE3),借助SDS-PAGE分析方法,对于用乳糖诱导,由T7 lac启动子控制的重组目的产物蛋白的表达规律进行了优化研究.在对诱导条件进行优化控制的前提下,分析比较了乳糖诱导pET28(a)/]-ggt和pET32(a)/γ-ggt两种重组质粒表达大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶蛋白的可溶性及酶活.实验结果表明,对于T7lac启动子控制的重组目 产物,乳糖作为诱导剂也可以起到很好的诱导表达效果,低温培养下,乳糖诱导pET3  相似文献
2.
绿色木霉葡聚糖内切酶Ⅰ(EGⅠ)基因克隆与表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
绿色木霉Sn-9106是一株分解纤维素能力较强、能利用秸秆固体发酵生产纤维素酶的工业菌株.通常丝状真菌纤维素酶合成受纤维素、槐二糖等的诱导.本研究利用秸秆粉诱导绿色木霉Sn-9106纤维素酶基因,在诱导3.5d时,纤维素酶组分之一——葡聚糖内切酶Ⅰ的mRNA转录达到峰值,收集菌丝提取总RNA,以单链cDNA为模板,PCR扩增获得编码葡聚糖内切酶Ⅰ基因(egl1),去除信号肽序列后构建重组质粒PET-egl1,实现其在大肠杆菌中的表达,所得重组葡聚糖内切酶经组氨酸标签亲和层析纯化得到单一的E-GI蛋白,SDS-PAGE检测为49ku,活力为2.37U/mL.  相似文献
3.
采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),以圆弧青霉BD26总RNA为模板,扩增出774 bp cDNA片段,将该基因片段克隆到表达载体pET-28a(+)上并转化Escherichia coil BL21(DE3),得到重组菌株BL21/ Lip PD。经IPTG诱导,菌体在固体琼脂显色平板上形成明显透明圈。SDS-PAGE电泳显示该脂肪酶分子质量约为27 ku。表达条件优化结果表明,当工程菌培养至OD_(600)为0.5时,加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L,在32℃诱导培养1 h,比酶活达29.30 U/mg。  相似文献
4.
应用IEDB、DNAStar、DNAMAN和Snap Gene等生物信息学工具对草莓轻型黄边病毒外壳蛋白的氨基酸残基序列进行分析。选择一段抗原性较强的肽段(位于外壳蛋白27~38氨基酸残基处),依据大肠杆菌(Escherichia coli)的密码子偏好性化学合成了该肽段的DNA编码序列(AE)。AE片段克隆至E.coli表达载体pET32a(+)的Eco RⅠ和XhoⅠ位点,获得重组质粒pET32a(+)-AE。含AE片段的开放阅读框长561 bp,编码了一个187氨基酸残基的重组融合蛋白,理论分子质量为20.29kD。重组质粒pET32a(+)-AE分别在E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta中进行了诱导表达和条件优化。重组融合蛋白在E.coli Rosetta中的最佳表达条件为1.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)、35℃诱导表达2 h,产率为13.22 mg/L;在E.coli BL21(DE3)中的最佳表达条件是为0.5 mmol/L IPTG、30℃诱导表达2 h,产率为9.55 mg/L。重组融合蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、质谱鉴定表明,其含有所预测的草莓轻型黄边病毒外壳蛋白抗原表位肽段AE。AE重组融合蛋白经Ni~(2+)亲和色谱纯化、EK酶切、分子筛除去融合蛋白标签后,免疫产蛋鸡。从免疫鸡所产鸡蛋中提取鸡卵黄免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk,Ig Y),Dot-Blot检测抗体结合活性。结果表明,所提取的IgY可特异性识别AE肽段和SMYEV外壳蛋白。这一结果表明所预测的AE肽段具有较好的免疫原性。  相似文献
5.
抗黄曲霉毒素B1独特型纳米抗体的表达及复性   总被引:1,自引:1,他引:0       下载免费PDF全文
目的 快速制备大量具有生物活性的独特型纳米抗体F7。方法 构建pET22b-F7原核表达载体, 转化至大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中进行诱导表达, 对诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间进行优化。结果 独特型纳米抗体F7表达量有所增加但主要以包涵体形式存在。经过包涵体的溶解、复性获得了具有生物活性的抗AFB1独特型纳米抗体, ELISA证实复性后的蛋白依然存在对鼠源AFB1抗体的结合特性。结论 为后续抗体的性质研究和改造奠定了基础。  相似文献
6.
阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因克隆、表达及活性研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:利用pET质粒原核表达体系克隆、表达阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因,表达产物进行Ni-NTA柱纯化,利用α-葡萄糖苷酶分解4-硝基苯基-α-D-呋喃型葡萄糖的特性进行表达纯化合的蛋白活性鉴定,为进一步制备阪崎肠杆菌检测用单克隆抗体奠定了基础.方法:从阪崎肠杆菌ATCC29544标准菌株中克隆获得阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因,连接pET22b( )表达载体后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用不同浓度的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达外源基因,分别检测不同诱导时间、不同浓度IPTG作用下表达产物,筛选高表达菌株.表达菌株大量培养后,超声波及蛋白酶K作用破菌,Ni-NTA亲和柱纯化目的蛋白,纯化产物进行酶活性的测定.结果:克隆获得的α-葡萄糖苷酶基因与NCBI收录的基因序列属等位基因,核苷酸位点有多处差异,氨基酸序列也有不同.构建表达载体并诱导表达后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,目标蛋白相对分子质量约为65kD,与理论值相符.目标蛋白量约占菌体总蛋白量的18%.同时,由纯化结果可以看出,以500mmol/L咪唑洗脱时的纯化效果最理想,蛋白纯度可达90%以上.对表达产物进行过酶活性初步检测证重组的阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶能够分解4-硝基苯基-α-D-呋喃型葡萄糖,产生蓝绿色.结论:本研究中克隆获得了阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因,通过构建pET22b( )-Glu表达质粒转化大肠杆菌可获得基因重组的高表达菌株,表达产物具有较好的酶活性,纯化后纯度可达90%以上.  相似文献
7.
原核表达重组牛凝乳酶原及重组牛凝乳酶酶学特性   总被引:1,自引:0,他引:1  
凝乳酶能够专一性裂解κ-酪蛋白,是制造干酪的关键酶。运用大肠杆菌表达系统对牛凝乳酶原进行了原核表达和初步纯化,活化重组凝乳酶原及测定凝乳活性,对重组凝乳酶的酶学特性进行分析。结果表明:大肠杆菌表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的66.3%,每升培养液可纯化约200 mg的重组凝乳酶原,活化后的凝乳酶活力可达600 000 SU/g。经测定凝乳酶最适作用温度为5762℃,并在pH 262℃,并在pH 27、低于40℃的温度范围内稳定。金属离子中Al3+,Fe3+和Cu2+能显著增强酶活;胃蛋白酶抑制剂pepstatin A对酶有明显的抑制作用。  相似文献
8.
牛凝乳酶全长cDNA的克隆及其原核表达载体的构建   总被引:1,自引:0,他引:1       下载免费PDF全文
从小牛皱胃中提取凝乳酶(Chymosin)总RNA,经过RT-PCR获得凝乳酶 cDNA,纯化后与pMD-18T载体连接,转化大肠杆菌JM109,通过双酶切和序列测定,获得了凝乳酶全长基因序列.序列测定表明,凝乳酶全长核苷酸长度为1 143 bp,编码381个氨基酸.与GenBank上已发表序列NM_180994进行比较,核苷酸同源性为99.56%.将该基因片段克隆到原核表达载体pET-22b中,构建重组质粒pET-22b/Chymosin,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为凝乳酶的进一步表达奠定了基础.  相似文献
9.
本研究目的为建立一种快速检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEK的双抗夹心酶联免疫吸附方法。将构建的原核表达载体pET-28a(+)-ΔNspSEK转化入BL 21(DE3)pLysS细胞中诱导表达,经Ni~(2+)-NTA亲和层析柱纯化获得重组SEK蛋白作为抗原。利用双抗夹心酶联免疫方法检测程序,确定抗SEK单克隆抗体及抗SEK多克隆血清的最佳稀释度,并使用该方法应用于检测SEK人工污染样品的加标回收率和茶多酚及乳酸链球菌素(Nisin)对7株sek阳性菌株的SEK蛋白分泌影响。结果表明,原核表达载体得到可溶性表达,重组SEK蛋白分子量约为27.7ku;建立的双抗夹心酶联免疫检测方法中,单克隆抗体最佳包被浓度为2.89μg/mL、抗血清的最佳稀释度为1:500,回归方程为y=0.2165x+0.1627,相关系数R~2=0.9993,最低检测限为0.1μg/mL;检测SEK人工污染脱脂奶、LB肉汤和牛肉糜中的加标回收率高达97%以上;并且,采用建立的方法测得茶多酚和Nisin的添加浓度在其MIC及以下浓度时,茶多酚对7株sek阳性菌株蛋白分泌抑制效果更明显。  相似文献
10.
根据NCBI中发表的大豆Rubisco小亚基基因(rbcS)序列(AF303939-1)设计特异引物,以吉农13大豆为实验材料,采用Trizol法提取叶片总RNA,通过RT-PCR克隆大豆rbcS的cDNA。将该基因与原核表达载体pET-30a(+)连接,转化大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞,双酶切鉴定后筛选阳性克隆,测序结果显示:rbcS全长696bp,其中开放阅读框为537bp,编码178个氨基酸;选择含大豆rbcS cDNA阳性克隆菌液IPTG诱导,经SDSPAGE分析,诱导表达出分子量为29.1kDa的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符。诱导7h蛋白表达量最高,为64.15%。  相似文献
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