基于IRES序列的多基因共表达载体构建

目的:构建一个IRES序列介导的多基因共表达载体,实现两个目的基因和筛选标记基因共用一个启动子高效表达,提高多基因稳定共表达细胞株的筛选效率。方法:以实验室前期构建的载体pLV-MCS-Puro为骨架,设计并全基因合成双基因克隆表达元件,连接到骨架载体,构建多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,以DsRed2和EGFP荧光蛋白基因验证该载体用于多基因稳定共表达细胞株筛选的效率。结果:成功构建了pLV-2MCS-Puro载体以及DsRed2和EGFP共表达重组质粒pLV-DsRed2-EGFP-Puro。瞬时转染实验证明该载体能介导多基因共表达。抗性筛选获得了MDCK和HeLa两种细胞的多基因稳定共表达细胞池。细胞池涂片荧光显微镜观察和计数表明抗性细胞池DsRed2和EGFP双阳率接近100%。基因组和转录水平PCR及蛋白质免疫印迹实验表明,DsRed2和EGFP稳定整合到抗性细胞基因组,并且两种蛋白质表达水平较为一致。结论:成功构建了多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,实现了两个目的基因和抗性基因串联共表达,并且具有高效的多基因稳定共表达细胞株筛选效率。该载体在研究蛋白质相互作用及工程细胞构建等方面具有一定的应用前景。     

酵母多基因表达载体在纤维素生物转化中应用

构建含酿酒酵母组成型强启动子PGK、G418抗性基因及rDNA片段的整合型载体pScIKP,利用rDNA多个同源重组位点,将外源基因以多拷贝整合到酵母染色体上,无需诱导即可持续表达;利用载体位于表达盒两端同尾酶,可插入多个基因表达盒,实现多基因稳定共表达.为检验共表达情况,反转录从绿色木霉中获得纤维素酶基因eg3和cbh2, 克隆并转化获得重组酵母菌株S.cerevisiae-ec. 该重组酵母能降解羧甲基纤维素形成水解圈;用羧甲基纤维素还原糖法和滤纸酶活力法测定酶活力,其最适温度和最适pH值与所表达单酶相似,表明共表达未影响两种酶的生物学特性;且双酶具有协同作用,能更有效降解非结晶纤维素.pScIKP载体能成功用于多个外源基因共表达和产物协同作用的研究,为构建能直接降解纤维素的酿酒酵母菌株,实现纤维素可再生能源的生物利用奠定了基础.     

共表达网络分析识别心肌分化过程中的关键因子

目的:心脏疾病末期伴随着心肌细胞的大量缺失,心肌细胞直接重编程有助于心肌细胞再生,使心脏功能得以修复。要提高直接重编程的效率,需要更清楚心脏发育过程中相关转录因子的调控机制,发掘关键转录因子。方法:从NCBI的GEO下载心肌发育的单细胞转录组测序(scRNA-seq)数据GSE76118,对单细胞数据进行预处理后,利用加权基因共表达网络分析算法构建转录因子之间共表达网络,寻找与心肌分化相关的功能聚类模块,之后结合网络拓扑性特征参数筛选关键转录因子,从而组建更高效的转录因子组合,进行实验验证。结果:从共表达网络中发现与心肌相关的功能模块,根据网络拓扑性挖掘到关键的候选因子。结论:构建基因共表达网络的分析方法,有利于发掘关键功能模块、关键节点基因,是探索细胞命运机制的一个高效途径。     

甘油脱水酶基因(gldABC)与1,3-丙二醇氧化还原酶基因(dhaT)的共表达

将dhaT基因片段以顺反子的形式插入到重组质粒pMD19TS2中gldABC基因的下游,形成重组克隆质粒pMD19TS3,进而将gldABC与dhaT基因以多顺反子的形式亚克隆至pET-28a(+)表达载体上。终浓度为1mmol/L IPTG诱导重组大肠杆菌E.coli/pET-28a(+)/gldABC-dhaT 2h,SDS-PAGE电泳分析结果表明分别在甘油脱水酶三个亚基分子量相对应的61ku、21ku、16ku和1,3-丙二醇氧化还原酶亚基分子量相对应的42 ku的位置上出现了特异性条带。上清液中酶活性分别为甘油脱水酶23.7U/mL,1,3-丙二醇氧化还原酶30.4 U/mL。     

面向时序基因表达数据的双聚类算法

对某种生物而言, 在某段连续时间内共表达的基因预示着其在同时完成某一生物过程或其间存在某种调控关系; 而目前在基因表达数据上的大多数双聚类算法都是针对非连续样本点的情况提出的, 对于连续样本点（样本之间存在顺序关系）的情况很少涉及。因此在考虑连续样本点的情况下, 提出了一种在时序基因表达数据上挖掘极大一致趋势共表达基因集的双聚类算法TCBicluster。在每个时间点产生行常量共表达基因集, 进而构造以时间点为顶点、以相邻时间点间满足一致性要求的共表达基因集为边的权值图, 并采用扩展连续时间点的方式对权值图进行双聚类挖掘, 使用有效的剪枝策略提高算法效率。实验证明, TCBicluster算法比RAP及CC-TSB算法更能有效挖掘极大一致趋势共表达双聚类且具有较高的效率和良好的可扩展性。     

重组大肠杆菌共表达D-海因酶和N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶

通过PCR分别扩增得到N-carbamoylase基因和上游带有RBS区的D-hydantoinase基因，并将其依次克隆入pBAD/His A质粒中，得到呈多顺反子结构的双酶表达质粒pBAD-CRH，转化E. coli Top10F￠得到重组菌TaraCRH. 实验证明，E. coli TaraCRH对外源蛋白的表达控制严紧，而加入阿拉伯糖诱导后可以成功表达两酶基因. 诱导条件优化结果表明，诱导温度采用29℃，培养基中阿拉伯糖浓度0.05 g/L可达到最高酶活. 进一步尝试采用玉米浆培养基代替LB培养基，在经过优化的玉米浆培养基中培养TaraCRH菌株，经阿拉伯糖诱导，海因酶和水解酶酶活分别达到3.52和4.21 U/mL.     

基于弹簧模型的基因表达数据可视化聚类

依据基因表达数据的特点,提出一种基于弹簧模型的基因表达数据可视化聚类方法,将多维空间的基因表达数据映射到二维空间中,较好地保持了原始多维数据间的时空相似性。实验结果表明,该方法能发现基因表达数据集中隐含的类簇结构以及共表达基因模式。     

基于角质酶共表达策略的大肠杆菌胞外生产耐高温α-淀粉酶及其发酵条件优化

在前期工作中通过分子改造提高了来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶在高温酸性条件下的稳定性,同时改良了催化效率。为了实现α-淀粉酶在大肠杆菌BL21(DE3)中的胞外高效表达,作者尝试采用共表达嗜热放线菌(Thermobifida fusca)角质酶来增强大肠杆菌膜透性,同时优化诱导策略以提高重组α-淀粉酶的胞外表达。首先构建了能同时表达角质酶和α-淀粉酶的工程菌BL21(DE3)/pETDuet-amy-cutinase,并将此菌株与能单独表达α-淀粉酶的工程菌BL21(DE3)/pET-20b-amy进行摇瓶和3 L发酵罐的产酶发酵对比。结果显示,共表达菌株在胞外产酶方面具有明显的优势。进一步对共表达菌株的诱导条件进行优化,在32℃、诱导剂为0.15μmol/L IPTG与0.5 g/(L·h)乳糖条件下,发酵32 h后胞外α-淀粉酶最高酶活力可达6.05×10~4U/m L,是单表达菌株摇瓶发酵水平的28.3倍。此时胞外重组α-淀粉酶质量浓度为8.92 g/L,重组蛋白质的分泌效率为93.2%。     

分子伴侣共表达对核糖核酸酶R可溶性表达的影响

核糖核酸外切酶R(RNase R)可降解几乎所有的线性RNA分子和Y结构RNA,但不易降解环形RNA(circ RNA)、套索结构(lariatRNA)和3’突出末端少于7个核苷酸的双链RNA分子,因此可以构建内含子c DNA文库用于可变剪切研究。本研究构建了含rnr基因的重组表达质粒pET-22b(+)-rnr,并将其表达产物纯化后通过SDS-PAGE分析和酶活性评价,确认rnr基因在大肠杆菌中已实现表达。之后构建4种分子伴侣共表达系统(pGro7、pKJE7、pTf16和pG-Tf2)。4种分子伴侣质粒分别与重组表达质粒pET-22b(+)-rnr共表达,筛选最适分子伴侣质粒,并优化共表达条件,提高目的蛋白可溶性表达。实验表明,分子伴侣质粒pGro7使蛋白表达量提高了43.80%,效果最为显著;20℃诱导时目的蛋白的可溶性表达最高;当L-阿拉伯糖浓度为0.50 mg/mL时,分子伴侣质粒pGro7使蛋白表达量提高了54.50%。通过使用分子伴侣共表达系统及优化表达条件提高了RNase R的可溶性表达,为该酶进一步研究奠定了基础。