Bacillus sphaericus DS11蛋白酶基因osp在Bacillus subtilis的异源表达及酶学性质研究

将Bacillus sphaericus 2297蛋白酶基因osp在Bacillus subtilis WB800异源表达,并进行纯化和酶学性质研究。以Bacillus sphaericus DS11基因组DNA为模板,扩增osp基因,构建重组质粒pMA0911-His_6-osp,重组质粒转化Bacillus subtilis WB800获得重组表达菌株Bacillus subtilis WB800-pMA0911-His_6-osp。利用镍离子柱亲和层析纯化重组酶至电泳纯。重组酶最适催化温度和pH值分别为40℃和pH 8.0,在20℃～30℃下保温10 h保持80%以上酶活力,在pH 7.0～9.0处理24 h保持60%以上酶活力;Sr~(2+)、K~+、Mg~(2+)对酶活有促进作用,Fe~(3+)、Ba~(2+)、Ca~(2+)对酶活有抑制作用;重组蛋白酶在极性常数为0.8～3.1的有机溶剂中孵育6 d后保持53%以上的酶活力。     

鱼肉质构的影响因素及测定方法研究进展

鱼类产品是居民膳食重要的动物性蛋白源, 而质构特征是评价鱼肉品质的关键指标。为系统总结分析影响鱼肉质构的主要因素, 本文首先分析了鱼肉质构与肌纤维、结缔组织及肌内脂肪的内在关系; 在此基础上, 从养殖方式、饲料配方、捕获季节及处死方式等角度综述了影响鱼肉质构的外在因素, 并分析了内源蛋白酶降解、细胞冷冻冰晶损伤及蛋白冷冻变性在低温贮藏鱼肉质构软化中的作用; 最后总结了鱼肉质构的仪器测定方法, 旨在为鱼类产品食用品质评价及控制提供理论参考。     

蛋白酶水解底物特异性机制研究进展

蛋白酶酶解底物位点的专一性,对酶解产物的组成与比例都有较大影响,直接影响最终产物的价值。酶法水解蛋白质存在水解效率低、特异性成分产率低以及后期纯化成本高等问题,使得特异性的酶解方式难以实现大规模工业化应用。解决这一问题则亟需探究蛋白酶特异性水解机理,得到酶解产物的分子机制。基于此,文章围绕蛋白酶的水解特异性,综述了目前与特异性相关的底物基团性质、结合部位氨基酸性质与空间位置,以及酶分子表面电荷等方面的相关机制,以期为今后蛋白酶的特异性酶解体系研究与应用提供参考。     

一株芝麻香型白酒高温大曲细菌Q2B1的鉴定及其产酶活性研究

大曲细菌关系到白酒酿造的品质，其中酶的含量与活性与白酒的风味紧密关联。以芝麻香型白酒高温大曲优势细菌代表菌株Q2B1为研究对象，利用分子生物学技术对其分类学地位进行研究，并通过全基因组研究技术对产酶相关功能基因与代谢通路进行研究。结果表明，菌株Q2B1被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。利用传统的培养技术定性定量地检测其酶活力，发现菌株Q2B1可产淀粉酶和蛋白酶，活力分别为5.852 U/mL和26.770 U/mL；其产酶相关功能基因组长度为3 475 602 bp，包括蛋白酶编码基因以及淀粉酶编码基因，在基因水平上初步揭示了Q2B1菌株合成蛋白酶和淀粉酶的分子机理，为进一步合理开发白酒大曲微生物奠定理论基础，为提高白酒品质提供科学依据。     

响应面优化碱性蛋白酶法提取藜麦淀粉工艺

采用青海高原藜麦作为原料,碱性蛋白酶作为酶解剂,研究藜麦淀粉的提取工艺。在单因素试验的基础上,以藜麦淀粉提取率作为评价指标,利用响应面法优化提取藜麦淀粉的工艺条件。结果表明:最佳工艺条件为酶添加量为0.598%,pH值为9.09,酶解时间为122 min,酶解温度为40.60℃,在此条件下藜麦淀粉提取率的预测值为89.26%。以最佳工艺条件对藜麦淀粉进行提取,验证试验中藜麦淀粉的提取率为(89.09±0.15)%,蛋白质残留率为(1.02±0.46)%。藜麦淀粉提取率的预测值与实测值的相对误差为0.19%,与所建立的模型预测值接近,表明此模型优化藜麦淀粉提取工艺具有可行性与科学性。     

复合蛋白酶水解黑豆粕制备多肽的工艺优化

为充分利用黑豆粕中的蛋白质资源,研究了复合蛋白酶水解黑豆粕制备多肽的工艺路线。从蛋白酶的筛选入手,考察了不同蛋白酶对黑豆粕水解效果的差异,并通过复配比例优化了最佳复合蛋白酶的组成。采用单因素试验及响应面试验确定了复合蛋白酶水解黑豆粕的最佳工艺条件。结果表明:最佳复合蛋白酶为胰蛋白酶、碱性蛋白酶与桔青霉蛋白酶按酶活比1∶3∶2复配;最佳工艺条件为加酶量5 670 U/g,底物蛋白质量浓度40 g/L,pH 9.55,水解温度50℃,水解时间6 h。在优化的工艺条件下水解黑豆粕,多肽得率可以达到82.44%。水解液中多肽的相对分子质量均在7.8 kDa以下,大部分多肽的相对分子质量小于3.3 kDa;多肽基本上保持了黑豆粕蛋白的氨基酸组成,具有较高的营养价值。     

B.cereus MBL13-U产牛骨胶原蛋白酶工艺优化

为了获得能够高效降解牛骨胶原蛋白的新型胶原蛋白酶,以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus MBL13-U)为出发菌种,以胶原蛋白酶活力为检测指标,对影响发酵的4个因素(菌种接种量、发酵温度、p H、发酵时间)进行单因素试验。通过四元二次正交旋转组合试验,确定了B.cereus MBL13-U菌株发酵制备胶原蛋白酶的最佳工艺。当菌种接种量4%(体积分数)、发酵温度35℃、初始p H6.4、发酵时间46 h时,胶原蛋白酶活力达(92.31±1.13)U/m L。将其作用于牛骨胶原蛋白,通过扫描电子显微镜对酶解过程中的牛骨胶原蛋白进行结构分析。分析结果表明:酶解破坏了牛骨胶原蛋白原本完整的表面结构,使其所含的Ⅰ型胶原蛋白更多地暴露在表面,加快水解。     

耐盐性谷氨酰胺酶在Bacillus subtilis 168中的整合表达

微生物质粒过表达外源基因,会由于质粒分离稳定性低、种子培养基中需添加抗生素等原因,限制其在工业生产中的应用。为了得到一株可用于工业生产谷氨酰胺酶的菌株,选择食品安全级Bacillus subtilis 168作为宿主,将来源于Micrococcus luteus K-3的编码耐高浓度盐的谷氨酰胺酶基因(Mglu)插入到其染色体上进行整合表达。选择了2个内源性蛋白酶基因作为整合表达位点,通过lox序列的重组消除抗性基因,得到无抗性基因的重组谷氨酰胺酶表达菌株。遗传稳定性研究表明,在不添加抗生素的条件下,通过连续传代重组菌株并测定发酵酶活,发现重组菌株连续传42代时,酶活基本不变。随后,采用5 L发酵罐对重组菌株进行分批补料发酵,最高酶活达到了41.5 U/mL。本研究对提高谷氨酰胺酶重组菌株遗传稳定性提供了借鉴。     

京尼平交联制备枯草杆菌碱性蛋白酶聚集体

本研究利用新型交联剂京尼平制备了枯草杆菌碱性蛋白酶交联聚集体(BAP-CLEAs)。以酶活回收率为指标,确定了BAP-CLEAs制备的最佳条件为:交联剂质量浓度0.50%,交联温度35℃,交联时间12 h,此时BAP-CLEAs的酶活回收率为55.04%。采用扫描电镜及红外光谱对BAP-CLEAs进行表征,结果证明枯草杆菌碱性蛋白酶在京尼平的作用下成功交联。与游离酶相比,BAP-CLEAs的最适p H值向碱性方向偏移,由9.4变为10.3,在较宽的p H范围和温度范围内保持较高的酶活。另外,在2%浓度的酪蛋白底物中重复使用5次后,BAP-CLEAs还能保持86.42%的酶活性。以上催化特性的结果表明,枯草杆菌碱性蛋白酶在京尼平的作用下可成功交联形成酶聚集体,且该交联酶聚集体具有比游离酶更优越的p H稳定性、温度稳定性和重复使用稳定性,有良好的工业应用前景。     

组合酶对复合骨素酶解液呈味物质的影响

为探究组合酶对牛骨素和鸡骨素的复合骨素酶解液呈味物质的影响,选取四种组合酶(木瓜蛋白酶+风味蛋白酶、菠萝蛋白酶+风味蛋白酶、碱性蛋白酶+风味蛋白酶、复合蛋白酶+风味蛋白酶)制备复合骨素酶解液,测定四种复合骨素酶解液的水解度、游离氨基酸、呈味核苷酸、味精当量(Equivalent umami concentration,EUC)、肽分子量分布等呈味物质指标,并进行对比分析。结果表明:碱性蛋白酶+风味蛋白酶(Alkaline proteinase+Flavourzyme,A+F)和复合蛋白酶+风味蛋白酶(Protamex+Flavourzyme,P+F)酶解液的水解度最大,分别为10.67%和11.27%;对呈味游离氨基酸组成分析发现,A+F酶解液鲜味氨基酸、苦味氨基酸、无味氨基酸含量最高,A+F和P+F酶解液总游离氨基酸含量最高;四种酶解液中肌苷酸较另两种核苷酸含量高,A+F酶解液总核苷酸含量最高;比较四种酶解液味精当量,A+F酶解液EUC值最大;A+F和P+F酶解液中分子量<1000 Da肽段含量最高,制备复合骨素酶解液的呈味效果更好;主成分分析表明A+F组合酶综合得分最高,A+F组合酶为美拉德反应提供丰富反应底物。