不依赖天然外显子的蛋白质内含子定向进化筛选系统

蛋白质剪接技术为在蛋白质水平上直接对蛋白质进行修饰和加工提供了一种全新的解决方案,因而在蛋白质工程及相关领域具有非常广阔的应用前景。现阶段,大部分天然的蛋白质内含子在异源蛋白质中剪接活性非常低,极大限制了蛋白质内含子的开发和应用。为了开发一个可以同时对蛋白质内含子通用性和剪接活性进行筛选的系统,利用Bsa I限制性内切酶识别位点和切割不重合的特性,将Ter ThyX内含子(不含外显子序列)插入到卡那霉素抗性蛋白基因的多个位点。并且摒弃了以往需要结合天然外显子以实现剪接的方法,可以同时对蛋白质内含子的剪接活性和通用性进行筛选。Western blot结果和卡那霉素平板生长结果表明,通过卡那霉素筛选系统可以精确的将蛋白质内含子剪接反应与卡那霉素抗性结合起来,仅从卡那霉素平板上的菌落生长情况即可完成蛋白质内含子剪接活性阳性突变的筛选,是一个快速,稳定的定向进化筛选系统。     

刚果红褪色法测定卡那霉素含量

根据硫酸卡那霉素与刚果红作用褪色的特性,建立一种利用可见光分光光度法测定硫酸卡那霉素含量的新方法。结果表明,在pH 5.8的HAc-NaAc缓冲溶液中,卡那霉素与刚果红络合后在480 nm处吸光度下降值与卡那霉素浓度(0.80~4.80 mg/L)线性关系良好,r~2=0.991 3。进一步的方法考察结果表明,该方法容易操作、结果可靠,可满足硫酸卡那霉素注射液的常规含量检测需要。     

石墨烯量子点荧光“开启”适配体传感器检测卡那霉素

该文开发一种基于结构转换适配体(aptamers)的新型高灵敏度荧光"开启"适配体传感器,用于快速、灵敏检测动物源性食品中卡那霉素(kanamycin,KAN)。适配体的结构转换诱导氮掺杂石墨烯量子点(nitrogen-doped graphene quantum dots,N-GQDs)的聚集/解聚行为,从而引起体系荧光的淬灭/恢复。与之前文献方法相比,该研究方法在效率、灵敏度、选择性和稳定性等方面均表现出优异性能:线性范围为0.1 ng/mL~10.0 ng/mL,检测限低至0.036 ng/mL(S/N=3),远远低于动物源性食品中KAN的最大残留限量。并且整个检测过程(包括样品提取)可在45 min内完成。此外,该方法成功用于5种动物源性食品样品(牛奶、蜂蜜、鱼、蛋、鸡肉)中KAN的检测。     

基于碳纳米管信号放大的卡那霉素高灵敏分析方法的建立

卡那霉素是一种氨基糖苷类抗生素,具有广谱抗菌性,在动物医疗中应用广泛,从而导致了其在动物源性食品中广泛残留,因此检测食品中卡那霉素的残留很有必要。作者以多壁碳纳米管(Multiwalled Carbon Nanotubes,MWCNTs)作为载体,通过EDC/NHS方法偶联抗体与信号分子辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP),合成多酶复合颗粒MWCNTs-Abs-HRP;建立基于MWCNTs-Abs-HRP多酶复合颗粒的检测方法,相比于已建立的传统竞争ELISA,灵敏度提高约5倍;并成功将此方法应用于牛奶样本中卡那霉素的检测。     

卡那霉素单克隆抗体制备以及化学发光免疫检测试剂盒的研制

通过卡那霉素与邻苯二甲酸酐反应,制备出卡那霉素半抗原,通过动物免疫、细胞融合,获得杂交瘤细胞株,再由杂交瘤细胞 株分泌得到抗卡那霉素单克隆抗体,从而制备出能够检测牛奶和奶粉样本中卡那霉素药物的化学发光免疫检测试剂盒。试剂盒对奶 粉的检测限为0.95 μg/kg,对牛奶的检测限为0.89 μg/kg,对牛奶的回收率为80.6%～105.6%,批内、批间相对标准偏差范围均＜10%。 卡那霉素单克隆抗体与链霉素、双氢链霉素、新霉素的交叉反应率分别为7.1%、9.0%、4.6%。 试剂盒至少能够在4 ℃保存1年。     

转fps基因烟草纯合系的获得及其特性分析

携带有外源法呢基焦磷酸合酶（fps）基因和卡那霉素抗性基因（Npt—Ⅱ）的烟草种子在含卡那霉素（300mg／L）的培养基上能够正常地萌发和生长，对照种子虽能萌发，但幼苗形态与对照有着明显的差异。转fps基因植株所具有的卡那霉素抗性和与其抗病性之间密切相关，由此建立了一种鉴定转基因烟草后代纯合度的简易方法，得到4个fps转基因烟草纯合系（K-4、K-6、K-17、K-35），并对其农艺性状、田间抗性、化学成份和品质进行了评估，其中K-4转基因品系的综合性状较原有品种有所提高。     

金纳米基比色传感器法测定动物源食品中卡那霉素残留

基于一定盐浓度下,金纳米粒子的聚集程度受附着于其表面的核酸浓度影响,以及卡那霉素(Kanamycin)能引起核酸适配体特定核酸构象变化而使其脱离金纳米粒子表面的特点,进而引起金纳米粒子颜色变化的结果,设计了一种新型检测动物源食品中卡那霉素的生物传感器。结果表明:此新型传感器对卡那霉素具有较高的灵敏度,且操作简单快速,易于普及和适于现场监控等。当卡那霉素浓度在50~200 nmol/L时,体系的吸光度A650/A519随卡那霉素浓度的变化而呈现线性关系,线性常数为0.999,检测限为30 nmol/L,且在实际样品检测中,测出其回收率为98.27%~104.31%。     

鄂尔多斯钝顶螺旋藻对三种抗生素敏感性研究

通过3种基因工程中常用抗生素对鄂尔多斯钝顶螺旋藻(S.erdosensis)生长抑制的研究发现,鄂尔多斯钝顶螺旋藻对氯霉素较敏感,液体培养1 mg/L的氯霉素即可抑制其生长,500 mg/L的氯霉素处理9 d产生完全致死作用;鄂尔多斯钝顶螺旋藻对氨卞青霉素和卡那霉素敏感性较弱,300 mg/L的氨卞青霉素和卡那霉素对鄂尔多斯钝顶螺旋藻生长的抑制不明显.结果表明,氯霉素是转化系统中较理想的抗性选择剂.     

羧酸型离子交换纤维对卡那霉素的吸附

测定了羧酸型离子交换纤维吸附卡那霉素的动力学曲线和吸附等温线,并研究了温度、pH值、盐浓度对吸附卡那霉素的影响. 研究结果表明,羧酸型离子交换纤维吸附卡那霉素在10 min达到平衡,其吸附平衡行为可用Langmuir方程描述;在pH 7时,羧酸型离子交换纤维吸附卡那霉素的静态交换容量为最大,可达5.6′104 U/g;羧酸型离子交换纤维吸附卡那霉素随温度变化很小;NaCl的存在使羧酸型离子交换纤维对卡那霉素的交换容量减小;对发酵液中卡那霉素的动态交换容量为5.16′104 U/g,洗脱率为88.1%.     

酶联适体分析法检测动物源性食品中的卡那霉素残留

建立了基于核酸外切酶Ⅰ的酶联适体分析法,用于测定动物源性食品中的卡那霉素残留。核酸适体和卡那霉素结合后,不再被核酸外切酶Ⅰ剪切,而能进一步联结辣根过氧化物酶(HRP),催化四甲基二苯胺底物显色,以450nm的吸光度与浓度的线性关系确定卡那霉素的检出限。考察了包被浓度、竞争反应时间、核酸外切酶I用量及封闭液等因素对检测的影响。在优化的实验条件下,建立的方法对卡那霉素检测有高灵敏度,检测限为3.26μg/L,线性范围5~100μg/L;在4种肉类中添加5.0、20.0、50.0μg/kg的卡那霉素时,加标回收率可达75.8%~90.6%,相对标准偏差RSD为4.2%~7.8%。该方法无需大型仪器,操作简单,可用于动物源性食品中卡那霉素残留的快速检测。