南美白对虾肝胰腺蛋白提取方法优化及无水保活环境胁迫对细胞凋亡蛋白的影响

为提高Western Blotting结果的可靠性，以蛋白溶出率和凝胶电泳蛋白条带完整性为指标，比较提取液种类、研磨方式、酶抑制剂种类及其体积分数和提取时间对南美白对虾肝胰腺蛋白提取效果的影响。采用优化后的提取方法获得高质量蛋白样品，并采用Western Blotting法分析无水环境胁迫后南美白对虾肝胰腺组织中细胞凋亡信号通路相关蛋白的表达水平。结果表明：RIPA裂解液作为提取溶剂所得的蛋白溶出率高于水提和磷酸盐缓冲液，电动匀浆和液氮研磨所得蛋白条带更完整，4%蛋白酶磷酸酶混合抑制剂能有效抑制肝胰腺内源酶引起的蛋白降解；采用Western Blotting法分析无水保活期间南美白对虾肝胰腺蛋白，发现低温诱导休眠的同时会引起细胞轻微凋亡，且凋亡水平呈应激时间依赖性增加，环境胁迫解除后有所回调。     

盐分胁迫对烤烟叶片亚细胞结构及生理生化指标的影响

  目的  探究不同浓度NaCl和Na₂SO₄溶液对烤烟叶肉细胞超微结构以及对叶片抗氧化系统的影响。  方法  利用透射电镜对不同浓度的盐溶液处理下烤烟叶肉细胞进行观察，并检测其抗氧化酶活性。  结果  在低浓度盐溶液（100 mmol/L NaCl和50 mmol/L Na₂SO₄）处理条件下，烤烟叶肉细胞壁厚度有所减小，细胞内各细胞器无明显变化。中等浓度NaCl（200 mmol/L）处理条件下，烤烟叶肉细胞的叶绿体背膜边缘模糊，嗜锇颗粒增多，淀粉粒含量减少；线粒体内出现空泡，嵴减少，部分膜结构边缘模糊；细胞核核仁密度降低，核膜凹凸不平。中等浓度Na₂SO₄（100 mmol/L）处理条件下，叶绿体基粒片层间空隙增大；线粒体形态饱满，但内膜凹陷；细胞核染色质分布均匀，但核仁边缘模糊。高浓度NaCl（400 mmol/L）使烤烟叶肉细胞叶绿体基粒片层结构失去完整性；线粒体结构瓦解，几乎没有完整结构的嵴。高浓度Na₂SO₄（200 mmol/L）处理条件下，叶绿体肿胀，变为球形，内膜及部分基粒片层溶解，淀粉颗粒进一步减少；线粒体内膜溶解，基质密度降低；细胞核核仁解体，甚至溶解消失。随着NaCl和Na₂SO₄浓度的升高，过氧化氢酶活性逐渐增强；丙二醛含量和超氧化物歧化等酶活性先升高后降低；过氧化物酶活性先降后升之后再降低。  结论  烤烟对Na₂SO₄溶液的耐受能力强于NaCl溶液。      

白藜芦醇对人髓母细胞瘤细胞Daoy增殖的影响及其作用机制

目的探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)对人髓母细胞瘤(medulloblastoma,MB)Daoy细胞增殖的影响及其可能的作用机制。方法体外培养Daoy细胞,用不同浓度的Res(10、20、40、80μmol/L)作用不同时间(24、48和72 h),CCK-8法检测Res对Daoy细胞的增殖抑制率;电镜观察Res对细胞内自噬溶酶体的形成情况;Cathepsin D活性检测试剂盒检测Cathepsin D活性;Western blot法检测Daoy细胞中Beclin 1、LC3、p62和溶酶体相关膜蛋白2(lysosomeassociated membrane proteins 2,LAMP2)的表达及3-甲基腺嘌呤(3-MA)和巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1)对Res作用的影响。结果 Res作用后,Daoy细胞的增殖抑制率随Res浓度的升高及作用时间的延长呈升高趋势;随着Res浓度的升高,Daoy细胞内自噬溶酶体形成数量、Cathepsin D酶活性、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值、Beclin 1、LAMP2蛋白的表达均呈上升趋势,p62蛋白表达下降。3-MA作用后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值、Beclin 1、LAMP2的蛋白表达水平明显下降(P <0. 05),p62的表达水平明显上调(P <0. 05);Bafilomycin A1处理后,Beclin 1、p62及LAMP2表达明显降低(P <0. 05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值明显增高(P <0. 05)。结论 Res可抑制髓母细胞瘤细胞Daoy的增殖,其机制可能与Res促进自噬形成与成熟过程有关。     

龙眼核活性脂质的分析及其细胞增殖活性研究

研究了龙眼核活性脂质的组成及其细胞增殖活性。以龙眼核为原料,经超声辅助提取、氯仿萃取、硅胶柱层析分离后得到富含植物甾醇和神经酰胺的活性脂质组分CEP-2;定性定量分析脂质中的活性成分,并在细胞水平上考察龙眼核活性脂质对人皮肤成纤维细胞(HSF)、人永生化角质形成细胞(Ha CaT)增殖活性的影响。结果表明:CEP-2中主要含有三萜类、神经酰胺类、鞣质及酚类物质,总甾醇含量为518. 26 mg/g,神经酰胺含量为2. 65 mg/g; CEP-2在质量浓度为40μg/m L时,HSF细胞的存活率为105. 28%;在质量浓度为100μg/m L时,对HaCaT细胞表现出明显的细胞增殖活性(p 0. 001),细胞存活率为114. 21%。     

樟树叶精油抗PM2.5致肺上皮细胞损伤的研究

以肺细胞A549为模型,研究樟树叶精油对PM2.5所致细胞损伤的拮抗活性。研究结果显示:樟树叶精油1.0 mg/mL以内对A549细胞增殖无影响,0.05～1.00mg/mL樟树叶精油对PM2.5所致的细胞毒性作用有显著拮抗作用(P0.05);樟树叶精油可显著降低染毒细胞中丙二醛(MDA)含量,增加超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和总抗氧化物质(T-AOC)含量(P0.05),表明樟树叶精油可通过抗氧化应激拮抗PM2.5致细胞毒性;樟树叶精油可显著降低染毒细胞中炎性因子TNF-α、IL-6的含量(P0.05),表明樟树叶精油可通过抑制炎症反应拮抗PM2.5致细胞毒性。     

青蛤多肽的酶法制备及对前列腺癌DU-145细胞的抑制活性

探讨青蛤多肽的制备工艺及体外抗前列腺癌DU-145细胞的活性。以氨基氮含量为检测指标,筛选最优酶种类并进行正交试验以获取最佳酶解青蛤内脏酶解工艺。经超滤截留、琼脂糖凝胶层析、高效液相色谱分离纯化及噻唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)活性筛选得到含有5个氨基酸的多肽(Ile-Leu-Tyr-Met-Pro)。对所得多肽采用MTT法测定DU-145细胞增殖抑制率;采用倒置显微镜、Hoechst 33258染色及透射电子显微镜技术观察细胞形态学变化;采用荧光法检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;采用线粒体膜电位检测DU-145细胞凋亡情况;采用免疫组织化学法检测非转移性克隆23型(nm23H1)蛋白的表达。结果表明:制备青蛤多肽最佳酶是木瓜蛋白酶,最佳酶解条件是料液比1:4、pH 7.0、加酶量1 500 U/g、温度45.0℃、酶解时间4 h;所得多肽对DU-145细胞的增殖具有明显的抑制作用,且呈时间与剂量依赖性;处理后的DU-145细胞出现凋亡的形态学特征;其质量浓度和细胞内ROS的表达量呈正相关关系;线粒体膜电位降低率从4.22%提高到25.07%;免疫组织化学法结果显示nm23H1蛋白的表达量增加。青蛤多肽能明显抑制DU-145细胞的增殖,并通过诱导其发生凋亡而发挥作用。     

细胞凋亡易感蛋白在睾丸癌中的表达及其对NT-2细胞增殖的影响

目的探讨细胞凋亡易感蛋白(cellular apoptosis susceptibility protein,CAS)在睾丸生殖细胞肿瘤(testicular germ cell tumor,TGCT)中的表达及其对NT-2细胞增殖的影响。方法免疫组化法检测CAS在正常人睾丸细胞及各种睾丸癌细胞中表达及定位;经转染腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)沉默CAS质粒(AAV-shCAS质粒)敲减NT-2细胞中CAS后,CCK-8法检测NT-2细胞生长活力,Western blot法检测CAS对NT-2细胞凋亡信号分子表达水平的影响。结果 CAS在正常人睾丸组织中呈中等强度表达,在癌旁睾丸组织中呈中、高强度表达,其中仅1份组织样本呈阴性;CAS在精原细胞瘤和胚胎瘤中呈低、高表达,其中,胚胎瘤中有1份样本呈阴性。CAS在正常人睾丸组织和癌旁睾丸组织中,主要表达于精母细胞胞核;精原细胞瘤和胚胎瘤中,CAS主要表达于细胞质。敲减CAS表达的NT-2细胞生长活力显著下降(P <0. 001),CAS、p65、RelB、Bcl-XL、Bcl-2的表达水平显著降低(P均<0. 05),p53表达水平差异无统计学意义(P> 0. 05)。结论正常人睾丸组织及TGCT中,CAS的表达位置不同;沉默NT-2细胞中CAS表达可通过抑制NF-κB/Bcl-2信号通路分子的表达从而抑制细胞增殖。     

Btk/JAK3双靶点共价抑制剂的设计、合成及其活性研究

布鲁顿式酪氨酸激酶(Btk)和两面神激酶3(JAK3)均是自身免疫性疾病和血液系统恶性肿瘤的潜力靶标。以4-氯吡咯并嘧啶为原料,经7步反应合成了一系列7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺衍生物,其结构经¹HNMR、¹³CNMR和MS(ESI)分析证实。体外依次考察了所得化合物分别对Btk和JAK3激酶的活性、以及对部分B淋巴细胞瘤细胞系的抗增殖活性。结果表明,四氢吡咯烷基取代的衍生物NB1~4对Btk(IC₅₀<3 nmol/L)和JAK3(IC₅₀<165 nmol/L)均能有效抑制,其余化合物只对Btk显示抑制效果;而且NB2和NB4对所测试的多种B细胞淋巴瘤细胞系的抗增殖活性均优于阳性对照泛激酶抑制剂依鲁替尼及Btk单靶点抑制剂。其中,对Jeko-1细胞的抑制能力最佳(IC₅₀<3μmol/L),其次是OCI-LYI(IC₅₀<4μmol/L)、SUDHL-6(IC₅₀<6μmol/L)和HBL-1^*(IC₅₀<6.5μmol/L),最差为SUDHL-4细胞(IC₅₀<11μmol/L)。这些发现可为开发B细胞淋巴瘤的多靶点药物提供新的思路。