Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中分泌途径的鉴定及其分泌能力的提高

食品安全（GRAS）菌株枯草芽孢杆菌由于其具有良好的分泌表达能力及易于基因工程操作等特性被广泛用作外源蛋白质的表达菌株。枯草芽孢杆菌中蛋白质的分泌大多依赖于信号肽介导的Sec分泌途径（General secretion pathway）和Tat分泌途径（Twin-arginine translocation pathway）。在本研究中，通过信号肽预测、蛋白质N端测序等手段发现来自于Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌并不依赖信号肽，该酶通过非经典蛋白质分泌途径（non-classical protein secretion pathway）进行分泌。通过信号肽筛选，发现最适合该酶在枯草芽孢杆菌中表达的信号肽为Tat分泌途径信号肽SP_phoD，并通过共表达分子伴侣PrsA的方式将该L-天冬酰胺酶的分泌量提高了72.11%。     

耐盐性谷氨酰胺酶在Bacillus subtilis 168中的整合表达

微生物质粒过表达外源基因,会由于质粒分离稳定性低、种子培养基中需添加抗生素等原因,限制其在工业生产中的应用。为了得到一株可用于工业生产谷氨酰胺酶的菌株,选择食品安全级Bacillus subtilis 168作为宿主,将来源于Micrococcus luteus K-3的编码耐高浓度盐的谷氨酰胺酶基因(Mglu)插入到其染色体上进行整合表达。选择了2个内源性蛋白酶基因作为整合表达位点,通过lox序列的重组消除抗性基因,得到无抗性基因的重组谷氨酰胺酶表达菌株。遗传稳定性研究表明,在不添加抗生素的条件下,通过连续传代重组菌株并测定发酵酶活,发现重组菌株连续传42代时,酶活基本不变。随后,采用5 L发酵罐对重组菌株进行分批补料发酵,最高酶活达到了41.5 U/mL。本研究对提高谷氨酰胺酶重组菌株遗传稳定性提供了借鉴。     

重组大肠杆菌表达17β-羟基类固醇脱氢酶全细胞催化合成宝丹酮的研究

宝丹酮作为一种重要的蛋白同化雄性激素类固醇，具有提升肌肉质量和耐力的功能。宝丹酮的传统合成方法是以1,4-雄烯二酮（ADD）为底物通过化学法合成，但过程复杂、污染严重。17β-羟基类固醇脱氢酶（17β-HSD）可催化甾体化合物C-17位点的氧化还原反应，实现ADD和宝丹酮的相互转化。本研究通过基因序列同源性分析，筛选到6种不同来源的17β-HSD基因并对其在大肠杆菌中进行异源表达。利用不同重组菌转化ADD合成宝丹酮，结果表明重组菌BL21/pET28a-HSDPy的ADD转化率最高，因此选择BL21/pET28a-HSDPy进行进一步研究。鉴定了重组菌的酶学性质并优化其全细胞转化条件。结果表明在生物量为36 g·L^-1、底物浓度为5.40 g·L^-1条件下，经过两次补料，获得了3.66 g·L^-1宝丹酮，比优化前提高了4.1倍。而且在生物转化过程中未检测到副产物。为生物合成宝丹酮提供了可能。     

定点突变提高食品新型L-天冬酰胺酶的活力及热稳定性

L-天冬酰胺酶（L-asparaginase II，EC 3.5.1.1）可将L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸，减少高温加工食品中丙烯酰胺的形成，因而受到人们的广泛关注。该酶在食品加工及预处理阶段的使用已受到人们广泛的关注，但是由于食品加工及预处理过程中环境的复杂性，对L-天冬酰胺酶的性质、热稳定性和酶活等方面有较高的要求。通过序列对比和同源模拟对嗜热菌Pyrococcus yayanosii CH1来源的编码L-天冬酰胺酶的基因PyAsnase进行了3个位点的突变，并在Bacilus subtilis 168 中进行表达，提高了该酶的热稳定性及比酶活。其中突变株E22K较原始菌株相比所得突变体比酶活提高了约37.3%，突变株R111L较原始菌株相比所得突变体的比酶活提高了约31.1%，突变株M92A较原始突变菌株相比所得突变体在85 ℃时的半衰期延长了约30 min。本研究结果为探索L-天冬酰胺酶结构和功能的相互关系提供了借鉴，提高了其在食品工业中的应用前景。     

再生粗集料影响混凝土抗氯离子渗透性能试验研究

采用ASTM C1202法测定混凝土6 h总导电量,研究再生粗集料取代率、压碎指标和含水率对再生混凝土抗氯离子渗透性能的影响。结果表明,再生粗集料取代率越大,混凝土的抗氯离子渗透性越差;随着再生粗集料压碎指标的增大,混凝土的抗氯离子渗透性减弱;再生粗集料含水率越大,混凝土抗氯离渗透性能明显提高。     

理性设计定点突变提高Streptomyces kathirae SC-1酪氨酸酶热稳定性

利用SWISS-MODEL在线服务器以栗色浑圆链霉菌(Streptomyces castaneoglobisporus)酪氨酸酶(PDB登录号:2AHL)为模板对S.kathirae酪氨酸酶的3-D结构进行同源模拟。使用在线预测软件PoPMuSiC-2.1计算酪氨酸酶每个突变氨基酸的去折叠自由能变化(ΔΔG)来辅助设计提高酪氨酸酶的稳定性,利用定点突变构建突变体,并且在大肠杆菌中对野生型酪氨酸酶及突变体进行表达,最终获得了两个热稳定性提高的突变体R95Y、G123W。在此基础上进行复合突变,获得了一个热稳定性显著提高的突变体R95Y/G123W。该突变体在60℃的半衰期提高了2.43倍,最适反应温度由45℃提高到50℃,本研究所用的基于蛋白质结构的理性设计提高稳定性的策略也可以应用于其他工业酶类,显示了良好的应用前景。     

高产精氨酸的钝齿棒杆菌在高低供氧条件下的差异蛋白质组学初步研究

溶氧水平直接影响钝齿棒杆菌合成精氨酸产量的高低,运用双向电泳结合MALDI-TOF-MS及MS/MS质谱鉴定技术的方法对高低供氧条件下高产精氨酸的钝齿棒杆菌的胞内可溶性蛋白进行分离鉴定.结果表明,钝齿棒杆菌菌体蛋白的等电点主要分布在4-7的范围内,采用pH4-7的IPG胶条进行分离,得到了645±12个蛋白点.通过软件...     

重组酿酒酵母生物合成菜油甾醇

菜油甾醇作为甾体药物（孕酮、雄烯二酮、氢化可的松等）的重要合成前体已受到国内外研究学者的广泛关注。首先通过生物信息学分析,筛选了10种不同来源的7-脱氢胆固醇还原酶DHCR7,并采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）内源的ERG5基因替换成不同来源的DHCR7基因,构建了菜油甾醇合成菌株。结果发现整合来源于Pangasianodon hypophthalmus DHCR7的菌株Zw507表现出最高的菜油甾醇的产量216.93 mg/L。进一步筛选了10种酵母内源启动强度较强的启动子来与PhDHCR7基因进行组合,结果显示以TEF1p为启动子时菜油甾醇的产量最高可达253.35 mg/L。为了进一步提高菜油甾醇产量,增加了DHCR7表达盒在酵母基因组上的拷贝数。当拷贝数为3个时,菜油甾醇的产量达到最高302.27 mg/L。最终,通过5 L发酵罐进行补料分批发酵,实现了916.88 mg/L菜油甾醇产量。该菌株可作为后续甾体药物生物合成的优良底盘细胞。     

基于ANSYS的副车架结构强度及模态分析

压裂车是石油压裂的核心设备之一,为了提高压裂车副车架的整体承载力,根据运载底盘的结构建立了压裂车副车架的三维模型,并运用有限元分析软件ANSYS对副车架及与其连接的附属支架进行了强度分析,通过分析确定了副车架受力薄弱的位置,为针对副车架结构强度的设计改进提供了理论依据;并对现有副车架进行模态分析,有效防止副车架与振动源发生谐振,确保了副车架作业过程中的可靠性,保证了整车的安全。     

一种耐低温α-乙酰乳酸脱羧酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

从Bacillus subtilis L5-20染色体上克隆得到ALDC基因alsD,构建重组表达载体pMA5-alsD-His,将其转化到B.subtilis WB600中。SDS-PAGE结果显示ALDC在重组B.subtilisWB600中成功表达,其相对分子质量(Mr)为32×103。采用Ni柱亲和层析纯化重组ALDC,所得纯酶的比酶活为272.3 U/mg,总回收率为89.8%。该重组ALDC最适反应温度仅为25℃,在20～35℃范围内均表现出较高的活性。Ni2+对ALDC有一定的激活作用,Fe3+使ALDC活性完全丧失。经摇瓶培养,重组菌的ALDC酶活为27.0 U/mL,约为出发菌酶活的70倍。经5 L的发酵罐发酵放大试验,ALDC酶活最高可达75.9 U/mL。