纤维素酶分子的计算机辅助序列分析

利用生物大分子数据库（EMBL、SWALL和PDB）及软件技术（DNASIS和AntheProt）对嗜热子囊菌（Thermoascus aurantiacus)的产生的一种纤维素酶分子进行了序列分析及结构预测；通过多种来源的纤维素酶的比较研究，分析了其催化区、活性位点及局部保守序列。     

葡萄糖氧化酶基因在黑曲霉中的分泌表达

通过PCR扩增从一株葡萄糖氧化酶生产菌黑曲霉中克隆得到1818bp葡萄糖氧化酶基因GOD,将GOD基因与糖化酶基因的5’同源臂、3’同源臂进行重叠延伸,构建葡萄糖氧化酶基因的表达框。将此表达框插入载体pSZH中,构建黑曲霉同源重组表达载体pSZH-GOD。将载体pSZH-GOD通过冻融法转化农杆菌AGL1,进而通过农杆菌介导法转化高产糖化酶的黑曲霉。经潮霉素筛选和PCR鉴定获得8株重组菌株。对8株重组菌株的发酵液上清液进行酶活测定,结果表明葡萄糖氧化酶基因在高产糖化酶的黑曲霉中得到了分泌表达,静置培养6d后其分泌表达的葡萄糖氧化酶酶活最高可达1.166U/mL,而在出发菌株中检测不到葡萄糖氧化酶的分泌表达。同时,重组菌株胞内表达的葡萄糖氧化酶最高酶活可达11.45U/mL,是出发菌株的266倍。此研究结果为简化葡萄糖氧化酶发酵生产工艺、提高酶产量提供了新的途径。     

瑞氏木霉内切葡聚糖酶基因在酿酒酵母中的表达研究

将PCR合成的瑞氏木霉 (Trichodermareesei) β 内切葡聚糖酶I(EGI)cDNA基因片断分别插入酵母met1 0和 pgk1启动子和终止子序列之间 ,构建了在不同启动子控制下 ,具有不同拷贝数的eg1表达分泌质粒pRS41 5ME、pRS41 5PE和 pRS42 5PE。通过电转化使重组质粒转移至实验室酿酒酵母H1 5 8菌株中 ,分别得到了 3株酵母转化子H1 p、H2p和H1m。在 3株酵母转化子中 ,重组 β 内切葡聚糖酶I都能在酶自身信号肽序列引导下进行分泌型表达。在YPD培养基中 3株重组酵母生长速率大致相同 ,H1m ,H1 p与H2 p的内切葡聚糖酶活力分别为 70 .4,1 2 6.7和 1 2 5 .0U/mL。     

瑞氏木霉木聚糖酶Ⅰ基因的克隆、序列分析及在酵母中的表达

本实验从构建于大肠杆菌DH5α的瑞氏木霉cDNA文库中用PCR法体外扩增到木聚糖酶I（XynI)的DNA片段，然后连接至穿梭载体pAJ401,转化酵母H158,以刚果红染色法筛选阳性重组子并测序，当将其mRNA5‘端非翻译区的79个碱基删除后，木聚糖酶的表达水平显著提高，有可能此基因的调节区位于5‘端非翻译区内，而且可能被酵母的相关基因表达因子所识别。     

纤维素酶分子的纤维素吸附区的研究进展

纤维素是生物界中最重要的碳源物质，其生物降解对维持地球上的碳素循环至关重要。其降解涉及到一系列的纤维素酶，是一个多酶协同的过程。近年来相继发现纤维素酶大都含有催化区和可与纤维素结合且氨基酸序列较为保守的功能区，即纤维素吸附区（cellulosebindingdomain,CBD）。通过序列之间的比较，用小角度X射线衍射、核磁共振及流水基簇分析等方法，在CBD的结构、功能及与纤维素的吸附机制等方面有了较深人的了解。本文为近十年来此领域研究进展的简述。     

瑞氏木霉纤维素酶基因在酿酒酵母中的表达研究

从瑞氏木霉（Trichoderma reesei）cDNA文库中克隆到外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ（CBHI）eDNA基因,将该基因分别连接到酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达载体pAJ401和pVT100_U上,构建了重组质粒pAJ401-cbhl和pVTIOO_U-cbhl。分别电转化2个重组质粒转移至酿酒酵母H158中,得到重组酵母HPC和HAC,实现了CBHI的分泌型表达。再将质粒pAJ401-cbhl转入已含有瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ基因egl的重组酵母Hlm中,构建了同时表达cbhl和egl的重组酵母菌株HMEPC。比较HMEPC和Hlm对纤维素底物的降解,前者滤纸酶活比后者提高14．3％,表明CBHI与EGI对滤纸降解有协同作用。     

丝状真菌斜卧青霉JUA-10具有启动子功能的DNA片段的克隆与表达

将斜卧青霉JUA－10染色体DNA的BamHI或PstI片段连接到大肠杆菌的启动子探针型载体pSUPV4上，克隆了7个不同大小的具有启动子功能的DNA片段。卡那霉素抗性试验表明，含重组质粒的大肠杆菌均能耐受100μg/ml以上的卡那霉素，最高可达1100μg/ml。说明斜卧青霉的某些DNA片段能在大肠杆菌中有铲地启动基因表达。取抗性水平最高的pPdsuI进一步进行限制酶谱分析，表明插入片段的分子量为2.4Kb.Southern杂交分析结果表明该插入DNA片段与斜卧青霉染色体DNA具同源性。