枯草芽孢杆菌整合载体的构建及基因组的改造

构建了两种整合载体,分别为单交换整合载体pACC-BdbDC和双交换整合载体pDsbE,pDGC,转化野生型枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168,目的基因整合到基因组上,同时引入氯霉素抗性基因。利用FLP/frt重组系统将氯霉素抗性基因敲除,便于宿主菌的进一步改造。PCR结果表明共重新构建了6种宿主菌。复杂双交换整合载体pDGC成功将3个目的基因整合到基因组上,为多个基因同时整合提供了一种方便可行的方法。     

胞外脂肪酶在枯草芽孢杆菌中的表达及其性质

枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis是一种高产的外源基因表达菌株,外源蛋白能大量分泌到细胞外培养基中.从地衣芽孢杆菌ATCC 14580基因组中克隆胞外脂肪酶全基因序列,并构建枯草芽孢杆菌表达载体pACC-pUB110,得到脂肪酶基因重组载体.该表达载体有一个强启动子,经淀粉诱导能高效表达外源蛋白,以枯草芽孢杆菌胞外蛋白酶缺失型菌株WB700和野生型菌株B.subtilis168为宿主菌,得到的脂肪酶以对硝基苯棕榈酸酯为底物,测得培养基上清总活力达到76.8 μ/mL.该脂肪酶在pH10~10.5表现最大水解活力,最适反应温度为37℃,在强碱条件下稳定性很好.     

青霉素酰化酶（PGA）在枯草芽孢杆菌基因组上的整合表达

将巨大芽孢杆菌的青霉素酰化酶(PGA)基因整合进枯草芽孢杆菌的基因组,筛选获得可以使PGA稳定表达的枯草芽孢杆菌菌株,克服了枯草芽孢杆菌中质粒表达不稳定的缺点.分别构建了含不同PGA基因拷贝数的3种枯草芽孢杆菌菌株,同时分析了这些菌株中PGA表达量的差异.37℃试管培养36 h菌株B.subtilis/xhoI-,aprE-,vpr--的酶活力为3U/L,菌株B.subtilis/xhoI::pga为6 U/L,菌株B.subtilis/xhoI::pga,aprE::pga为14 U/L,菌株B.subtilis/xhoI::pga,aprE::pga,vpr::pga为23 U/L.结果表明,整合的拷贝数越多,PGA的表达量越高.