解淀粉芽孢杆菌BW-13培养基和培养条件优化

为了提高解淀粉芽孢杆菌Bacillus am ylolique aciens BW-13抗真菌活性物质的产量,本实验首先用单因素研究不同碳源,氮源和微量元素对BW-13产生抗真菌活性物质的影响,并使用均匀设计法对培养基进行优化.结果表明:玉米粉和低浓度的Mn2+对BW-13产生抗真菌活性物质的促进效果明显.最佳培养基配方和发酵条件为:玉米粉32 g/L,蛋白胨9 g/L,氯化锰5 mg/L,初始发酵pH5.0,装液量30 mL,接种量为4％,培养温度28℃,摇床转速200 r/min,培养时间144 h.优化后5 μL BW-13发酵液抑菌圈提高到28.5 mm,比优化前提高了28.94％.     

荧光定量环介导等温扩增法快速检测食品中沙门氏菌

目目的 建立一种快速简易检测食源性沙门氏菌的实时荧光定量环介导等温扩增（quantitative loop-mediated isothermal amplification, qLAMP）方法。方法 依据沙门菌属invA基因序列设计引物, 并结合短时间增菌构建沙门氏菌快速检测qLAMP法, 使用人工污染样品进行验证。结果 建立的qLAMP法最佳反应时间为40 min, 最佳反应温度是65 ℃, 最佳Mg2+浓度为6 mmol/L, Bst 2.0 WarmStart聚合酶的浓度为0.40 U/μL, 反应特异性良好, 纯培养实验表明方法检出限为100 CFU/mL。将沙门氏菌人工添加至鸡胸肉、果蔬沙拉、山泉水中, 经过7 h BPW有效增菌后所建立的qLAMP法在食品基质中的检出限达到5 CFU/25 g。结论 该方法准确、简单易行, 实验成本低, 可用于食品中沙门氏菌的快速检测。通过WarmStart Colorimetric LAMP试剂盒无需昂贵仪器即可快速检测,为沙门氏菌现场即时检测的场景提供技术支持。     

食品沙门氏菌环介导等温扩增技术应用研究进展

沙门氏菌引起的人畜共患疾病每年引发大量财产损失,快速简易的检验方法对于食品沙门氏菌的检验至关重要。环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）作为PCR的有力替代工具,经历多年发展已在等温扩增领域显示出明显优势,在沙门氏菌检测应用方面也日渐成熟。本文对近五年来LAMP技术在沙门氏菌检测中的应用和LAMP技术检测平台进行了分析汇总。在沙门氏菌LAMP技术的特异性方面,对现有靶标基因的有效性和新靶标基因的有效性进行了探讨,对不同血清型的特异性检测和多重LAMP的应用进行了总结,分析其优点与不足之处,以此说明探针法、多重检测,微流控技术和即时检测（Point-of-Care Testing, POCT）是沙门氏菌LAMP技术的未来发展方向,为LAMP技术更好地应用于沙门氏菌检测提供参考依据,对于提高食品中沙门氏菌的检验能力具有重要意义。     

基于ttr基因的mini-MPN-qLAMP法快速定量检测食品中沙门氏菌

该研究通过3管型微量MPN计数法（Mini Most Probable Number,mini-MPN）建立了一种快速定量检测食源性沙门氏菌的荧光定量环介导等温扩增（Quantitative Loop-Mediated Isothermal Amplification,qLAMP）方法。依据沙门菌属ttr基因设计了qLAMP和荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR）引物,结合5 h BPW增菌和MPN计数法建立了mini-MPN-qLAMP沙门氏菌快速定量检测方法;使用两种人工污染样品对mini-MPN-qLAMP法进行验证,使用Bland-Altman分析比较不同检测方法检测结果的一致性。结果表明,建立的qLAMP法与qPCR法反应特异性均良好,纯培养时qLAMP法检出限为500 CFU/mL。通过Bland-Altman分析表明所建立的mini-MPN-qLAMP法在速冻乌米饭中检测结果与mini-MPN-qPCR、mini-MPN计数法、平板计数法相比均具有较高的一致性,r2≥0.994,检出限为-0.44 lg MPN/mL;而在速冻鸡胸肉中该法检测结果与mini-MPN-qPCR结果一致性最佳,r2=0.990,检出限为-0.64 lg MPN/mL。肉制品中腐败杂菌会影响mini-MPN计数和平板计数结果,mini-MPN-qLAMP可排除肉制品中腐败杂菌对检测结果的影响。该研究所建立的mini-MPN-qLAMP法简单易行,准确度高,可用于食品中沙门氏菌的快速定量检测。     

解淀粉芽孢杆菌BW-13产生的抗真菌物质特性研究与初步分离纯化

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylolique aciens)BW-13发酵滤液对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和植物病原真菌灰霉(Botrytis cinerea)均具有显著的抑制活性,并具有热稳定性好、对紫外线照射和蛋白酶处理不敏感、在pH 3～9范围内稳定,尤其在酸性条件下基本不丧失活性的特点.通过发酵液预处理,活性炭吸附,D293强碱性季铵型阴离子交换树脂柱层析,对解淀粉芽孢杆菌BW-13产生的抗真菌物质进行了初步分离纯化.高效液相色谱(HPLC)分析显示分离得到的抗真菌物质在220 nm处有单一的活性峰.     

肉制品生产工艺对沙门氏菌活的非可培养状态的诱导及检测方法研究

目的 探索肉制品生产工艺对活的非可培养(viable but non-cultruable, VBNC)状态沙门氏菌的诱导因素,并建立一种快速检测肉制品中VBNC状态沙门氏菌的检测方法加以应对。方法 通过高温、低温、高渗透压、防腐剂、杀菌剂等生产工艺处理获取VBNC状态沙门氏菌,使用脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate, SD)和PMAxx处理菌液,依据ttr基因进行荧光定量PCR(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)建立SD-PMAxx-qPCR法进行检测。采用人工污染的方式对VBNC状态沙门氏菌进行检测和验证。结果 65℃处理40 min可使沙门氏菌快速进入VBNC状态,添加0.1 g/L山梨酸冷藏状态可使少量沙门氏菌缓慢进入VBNC状态。。SD-PMAxx-qPCR法能显著区分沙门氏菌的存活状态,最佳条件为0.08% SD,20 μmol/L PMAxx,黑暗孵育10 min,光解10 min。纯培养时活菌的检出灵敏度为100 CFU/mL,添加高浓度死菌时,检出灵敏度不变。通过人工污染添加至样品时,需要对样品进行涂布确认其沙门氏菌不可培养,通过100℃加热样品10分钟作为阴性对照,从而对比Ct值实现样品中VBNC状态沙门氏菌的检测。结论 沙门氏菌在肉制品生产过程中容易受到多种因素诱导进入VBNC状态,本研究建立了SD-PMAxx-qPCR法快速区分沙门氏菌的存活状态,可用于肉制品中VBNC状态沙门氏的检测,为肉制品安全生产提供技术保障。     

mini-MPN-STE-qPCR法快速定量检测食品中沙门氏菌

目的 建立一种快速、简易、可定量检测食源性沙门氏菌定量PCR(quantitative PCR, qPCR)方法。方法 依据沙门菌属invA基因序列设计染料法qPCR引物, 建立基于嵌合荧光法的沙门氏菌qPCR检测方法, 并通过短时间增菌(short time enrichment, STE)的5管微型多管发酵计数法（mini-most probable number, mini-MPN）进行定量检测, 构建mini-MPN-STE-qPCR法。使用人工污染的鸡肉混合液进行定量检测, 检测结果与传统MPN计数法和平板计数法进行比较分析。结果 建立的 qPCR法特异性良好, 方法灵敏度为50 CFU/mL, 结合48孔板min-MPN和4h 短时间增菌建立的mini-MPN-STE-qPCR法可将整个检测流程缩短至7 h。人工添加沙门氏菌的鸡肉混合液检测结果表明方法检出限为-0.347 log MPN/mL, Bland-Altman分析结果显示, 此法与传统MPN计数法相关系数R2=0.994, 与平板计数法相关系数R2=0.992。结论 该方法准确、简单易行、成本低、灵敏度高, 可用于食品中沙门菌的快速定量检测。