中国流行株HIV-1B/C重组亚型包膜蛋白真核表达载体的构建及稳定表达细胞株的筛选

目的获得高质量的中国流行株HIV-1B/C重组亚型包膜蛋白抗原。方法改造表达载体,以构建中国流行株HIV-1B/C重组亚型包膜蛋白基因带有筛选标记的真核细胞表达质粒,将所构建质粒转染真核细胞,用含有抗性的培养基筛选出能够高效、持续表达包膜蛋白的稳定表达细胞株。结果所构建的表达载体pVRPEnv转染细胞后可表达目的蛋白,并建立了稳定表达细胞系。结论获得了可以高效、持续稳定表达中国流行株HIV-1B/C重组亚型包膜蛋白的细胞株。     

人乳头瘤病毒16型晚期蛋白L1基因重组MVA病毒的构建及鉴定

目的研制预防人乳头瘤病毒(HPV)感染的重组修饰的Ankara痘病毒(MVA)活载体疫苗。方法将HPV16L1基因插入MVA病毒转移载体psc11M2的P7·5启动子的下游,构建转移质粒psc11M2-L1,与MVA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),进行同源重组。通过9轮蓝斑筛选,以PCR和Westernblot鉴定重组病毒。结果获得的含目的片段的重组MVA病毒,表达产物与鼠抗人HPV16L1抗体发生阳性反应,目的蛋白相对分子质量约为55000。结论已成功地构建了可正确表达HPV16L1基因的重组MVA病毒株。     

狗心脏中I_(to)相关钾离子通道表达分析

目的探讨钾离子通道Kv4·3和Kv1·4在正常与心衰的心肌组织中的表达差别,为进一步阐明心衰的发病机理奠定基础。方法建立狗的心衰模型,用Western blot方法对正常与心衰的狗心肌组织中Kv4·3、Kv1·4及辅助亚基Mink的表达进行分析。结果在心衰时,Kv4·3表达有明显下降;Kv1·4表达有所上升,在心肌组织的不同部位,即外层和内层Kv1·4的表达明显不同;同时Mink的表达在心肌外层也有明显下降。结论心衰时,心肌组织中形成Ito的钾离子通道Kv4·3和Kv1·4以及辅助亚基Mink的蛋白表达变化之间可能存在着一些相关性。     

Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白的表达及纯化

目的获得高纯度的Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白。方法以Vif/VR1012质粒为模板,PCR扩增出Vif-ΔN28基因并插入pRSETB质粒。将构建的原核表达载体Vif-ΔN28/pRSETB以及已有的Cullin5-N138/pRSETB质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,产物经Ni-NTA离子纯化柱纯化、复性。结果所表达的Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白约占各自菌体总蛋白的20%,纯化后蛋白纯度均可达90%以上。结论已成功构建了Vif-ΔN28原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达,获得了可溶性的纯化的Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白。     

表达HIV-1 Gag-Pol抗原的重组痘病毒的构建及免疫原性

目的构建稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的重组痘病毒载体疫苗,并检测其体液免疫效果。方法将修饰型HIV-1Gag-Pol基因插入到痘病毒表达载体pSC11m2启动子P7·5下游,经与野生型痘病毒同源重组后,进行蓝白斑筛选。用筛选得到的重组病毒rM-GP转染HEK293细胞,经SDS-PAGE和Westernblot检测表达蛋白。用该重组病毒免疫BALB/c小鼠,并检测体液免疫应答。结果已筛选到稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的重组痘病毒载体rM-GP,经Westernblot,在免疫小鼠血清中检测到抗HIV-1p24蛋白的特异性抗体。结论重组痘病毒载体rM-GP能稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白,并能引起有效的体液免疫应答。     

HIV-1中和抗体检测方法的建立

目的以荧光素酶作为报告基因,表达假病毒,建立快速、有效的HIV-1中和抗体检测方法。方法将HIV-1中国流行株B/C重组亚型和C亚型Envelope基因的真核表达质粒分别与带有荧光素酶报告基因的pNL4-3.Luc.R-E质粒共转染293T细胞,培养48h后收获含有假病毒的上清液,感染表达CD4受体和一个辅助受体CCR5的HOS细胞,培养72h后,裂解细胞,检测荧光素酶含量。结果HIV-1的B/C重组亚型和C亚型Envelope基因真核表达质粒分别与pNL4-3.Luc.R-E质粒共转染的293T细胞,均有HIV-1结构蛋白Gagpol和Env的表达,相对分子质量分别为55000和160000,用产生的假病毒感染HOS-CD4-CCR5/CXCR4细胞后,产生的荧光素酶含量明显高于对照组。结论已建立了瞬时转染检测HIV-1中和抗体的方法,为今后抗体样本及病毒样本的检测提供了参考。     

阿尔采默病治疗性疫苗原核表达载体的构建

目的构建阿尔采默病治疗性疫苗原核表达载体。方法选择Aβ42的B细胞优势表位的15个氨基酸基因序列,与趋化因子BCA-1基因连接,克隆至经突变改造的原核表达质粒pRSET/no His中,经酶切和DNA测序鉴定重组质粒。结果酶切鉴定及DNA测序确定已将BCA-1/Aβ1-15克隆到表达载体pRSET/no His中。结论已成功地构建了Aβ42亚单位疫苗的原核表达质粒。     

稳定表达HIV-1病毒样颗粒的293细胞系的筛选及其稳定性

目的获得高效、稳定表达含有HIV-1主要结构蛋白gag、pol和env的病毒样颗粒的293细胞系。方法选择合适的真核细胞表达质粒与带有抗性基因的载体,共转染293真核细胞,用含有抗性的培养基筛选出稳定表达细胞株。结果HIV-1的gag、pol和env蛋白均在293细胞中获得了表达,且不同代次的293细胞中蛋白表达情况无明显差异。结论成功筛选了稳定表达HIV-1病毒样颗粒的293细胞系,为进一步开发艾滋病疫苗奠定了基础。     

HIV-1 Vif基因的克隆与原核表达

目的克隆HIV-1Vif基因编码区序列,并在原核细胞中表达。方法构建原核表达载体pMRI,将Vif基因序列克隆至该载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,菌体裂解后获得特异性表达蛋白,用组氨酸标签特异性亲和树脂分离纯化该蛋白,并经SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果表达质粒pMRI-Vif经双酶切,可见约600bp的Vif基因片段,测序结果证明质粒构建正确。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了可溶性Vif蛋白,纯化后经凝胶自动扫描分析,纯度达85%以上,蛋白浓度约为1g/L。纯化产物具有良好的抗原特异性。结论在大肠杆菌中高效表达了可溶性Vif蛋白。     

鼠白细胞介素-2(mIL-2)真核表达质粒的构建及蛋白检测

目的构建重组鼠白细胞介素2的真核表达体系,获得mIL2基因的表达质粒,用其提高DNA疫苗的免疫原性。方法从经PMA刺激的小鼠脾细胞中提取总RNA,采用RTPCR技术调取鼠白细胞介素2基因,并将其克隆至真核表达质粒VR1012中,转染COS7细胞,将转染细胞裂解,进行Westernblot检测。结果获得完整的带有信号肽的mIL2序列的质粒,经Westernblot检测阳性。结论构建了mIL2真核表达体系,并获得有生物活性的mIL2蛋白。