人血浆蛋白C的纯化与鉴定

目的　建立人血浆蛋白C的纯化与鉴定方法。方法　利用DEAE SephadexA 5 0代替氯化钡 ,对血浆进行预处理 ,再经DEAE SepharoseFF离子交换和肝素 SepharoseCL 6B亲和层析进行分离纯化 ,用活化的部分凝血活酶时间 (APTT)测定组分活性 ,非还原型SDS PAGE测定其相对分子质量 ,Westernblot鉴定其特异性。结果获得相对分子质量为 6 2 0 0 0的蛋白条带 ,此条带可与人蛋白C单克隆抗体发生特异性反应。结论　已成功地从血浆中分离到蛋白C ,为其规模化生产奠定了基础。     

重组人凝血因子Ⅶ在Flp-In-CHO细胞中的表达及鉴定

目的利用Flp/FRT位点特异性重组技术,在Flp-In-CHO细胞中表达重组人凝血因子Ⅶ(rhFⅦ),并进行鉴定。方法用限制性内切酶EcoRⅠ和EcoRⅤ分别双酶切质粒pT-FⅦ与表达载体pcDNA5/FRT/TO,将回收的目的基因片段和载体片段连接,构建重组表达质粒pcDNA5/FRT/TO-FⅦ,并与辅助质粒pOG44共转染Flp-In-CHO细胞,经400μg/ml潮霉素B压力筛选,获得抗性细胞株。采用PCR、RT-PCR、Western blot和PT等方法对筛选出的细胞株分别进行基因组水平、mRNA水平、表达水平和蛋白活性的鉴定。结果重组表达质粒pcDNA5/FRT/TO-FⅦ经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;筛选出9株抗性细胞;外源基因FⅦ定点整合到Flp-In-CHO细胞基因组中并得到表达;重组蛋白表现出与血浆FⅦ相一致的促凝活性。结论利用位点特异性表达系统Flp/FRT,在Flp-In-CHO细胞中成功表达了hFⅦ,为其制备和纯化奠定了基础。     

低温乙醇法分离血浆蛋白过程中灭活和清除HIV的论证

<正> 自80年代艾滋病的发现以及凝血因子制剂使用发生HIV传播后,人们对广泛采用的低温乙醇法制备的血液制品的安全性产生疑虑。为此,围绕着代表当今世界上低温乙醇法的两大流派——Cohn改良工艺Cohn-oncley法以及Kistler and Nitschmann法     

高效液相色谱法测定静脉注射犬血免疫球蛋白的麦芽糖含量

目的采用高效液相色谱法测定静脉注射犬血免疫球蛋白中的麦芽糖含量。方法采用苯乙烯-二乙烯基苯共聚物为基质的阳离子交换色谱柱(300mm×7.8mm,8μm),流动相为0.004mol/L硫酸溶液,流速为0.8ml/min,柱温50℃;将麦芽糖含量与其峰面积进行直线回归,建立标准曲线;样品经磺基水杨酸处理后进样,根据峰面积计算麦芽糖含量。结果该方法的标准曲线相关性良好,r=0.99968,精密性检测RSD为0.35%,回收率为99.58%。结论高效液相色谱法快速、准确、回收率高,适用于检测静脉注射犬血免疫球蛋白的麦芽糖含量。     

pRL-hTNF/JM103工程菌发酵和rhTNFα表达的研究

为便于下游中试规模生产,采用温度敏感型启动子PRPL构建rhTNFα工程菌,并对影响工程菌发酵培养和表达的因素进行了初步研究。结果显示,采用RTB培养基,50℃热水快速升温,诱导培养4～4．5h,湿菌体收获率和表达量均达到较高水平;50L发酵罐连续发酵3批,14000r／min连续离心,菌体收获率湿重达16．gg／L培养物,rhTNFα表达量占菌体总蛋白的10.5％,活性达1．35×107U／mg蛋白。.     

重组人肿瘤坏死因子α(rhTNFα)衍生物的纯化及检定

采用热处理、盐析和离子交换层析技术对新型人肿瘤坏死因子α衍生物 (命名为hTNFD)蛋白进行了纯化 ,纯化后的纯度大于 96 % ,回收率为 43.8% ,纯化倍数为 6 .4倍。经L92 9细胞测活结果表明 ,hTNFD的比活可达 1.0 1× 10 1 0 U mg ,比原型TNFα活性提高 46 5倍 ,整个纯化工艺简单、稳定 ,易于放大 ,显示出较好的临床应用前景 ,     

重组人蛋白C在HEK293细胞中的表达与鉴定

目的获得转染人蛋白CcDNA的工程细胞株,实现重组蛋白C的表达。方法将构建好的重组表达载体pIRES-hPC用脂质体介导的方法转染HEK293细胞,经G418加压筛选、细胞有限稀释法等获得克隆细胞株,收集无血清培养上清,浓缩后进行鉴定。结果经G418筛选得到了21株克隆化细胞,SDS-PAGE和Westernblot鉴定表明,表达产物含有人蛋白C,且具有抗凝活性。结论在哺乳动物细胞中已成功表达重组人蛋白C,为进一步深入研究及产业化奠定了基础。     

α2-巨球蛋白的分离纯化及临床应用

α2-巨球蛋白(α2-macroglobulin,α2-M)是一种大分子糖蛋白,主要存在于人体的血浆中,是一种广谱蛋白酶抑制剂,可清除内源性及外源性蛋白酶。制备α2-M工艺的起始原料多为人血浆,实验室制备工艺大多结合使用免疫亲和层析、凝胶过滤、Cibacron蓝色琼脂糖亲和层析等,而规模化制备工艺一般先使用硫酸铵、利凡诺、聚乙二醇等方法进行粗分离,再使用锌离子亲和层析、凝胶过滤等方法进行精细分离。α2-M用于治疗放射性皮肤黏膜溃疡损伤、放射性肺炎、放射性膀胱炎、角膜炎及角膜溃疡具有良好效果。α2-M还可作为判断肝纤维化分期、胰腺炎病情轻重的一个生物标记物。本文主要就α2-M的制备工艺及临床应用作一综述。     

人蛋白C cDNA突变体的设计、克隆与序列分析

目的 通过对人蛋白C cDNA的定点突变,构建人蛋白C突变体cDNA,以期实现从哺乳动物细胞中直接表达出具有生物活性的人蛋白C产物。方法 针对人蛋白C cDNA序列设计引物以引入突变序列,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和重组PCR方法,从人胎肝总RNA中分别钓取人蛋白C的重链和轻链,经重组PCR反应将两者连接,然后将其克隆入pGEM-T载体中,经酶切和PCR鉴定后进行测序。结果 经RT-PCR和重组PCR扩增获得大小为1374 hp的cDNA片段,并成功构建了人蛋白C cDNA突变体的克隆质粒pGEM-T/mhPC,序列分析证实所引入的编码8个氨基酸短肽的核苷酸序列突变位点正确取代了人蛋白C的活性肽,获得人蛋白C突变体cD-NA的克隆。结论 已成功进行了人蛋白C cDNA的突变,获得了人蛋白c cDNA突变体的克隆,为进一步进行人蛋白C突变体cDNA的表达和活性鉴定奠定了基础。     

人蛋白C转基因小鼠的建立及乳腺表达

目的为了获得乳腺定位表达人蛋白C(hPC)的转基因动物。方法采用分步克隆的方法,构建大鼠乳清酸蛋白(WAP)启动子调控的人蛋白C质粒,命名为pWPC。将该质粒系统鉴定后,用PvuⅠ+SmaⅠ双酶切,回收4·6kb的片段(WAP-hPC-PolyA)。通过显微注射技术,将其注入昆明小鼠受精卵雄原核内;共注受精卵810枚,存活640枚,移植给28只假孕母鼠,怀孕的18只母鼠共产仔81只。结果提取鼠尾基因组DNA进行PCR检测,34只阳性,再经Southernblot检测,其中20只整合阳性;将7只整合阳性母鼠传代,产仔7日后收集乳汁,进行ELISA检测,结果均有表达。结论已成功建立了人蛋白C转基因鼠乳腺生物反应器,为hPC乳腺表达研究奠定了基础。