固定化辅酶B_6(PLP)的研究

关于固定化酶的文献报导很多,但是,对于需要辅酶的酶的固定化的报导却很少。国外S.Ikeda等人用5′-磷酸吡哆醛联接琼脂糖来固定化各种含辅酶B_6(PLP)的酶或直接用琼脂糖来固定化含辅酶B_6(PLP)的酶。如图1。辅酶B_6(5′-磷酸吡哆醛;简称PLP)。以PLP为辅酶的不同酶催化各种氨基酸的反应,包括转氨作用,脱羧作用,β-羟基氨基酸的脱水作用,α-D-氨基酸的消旋作用和半胱氨酸的脱巯基作用等。在这些酶促反应中,PLP起了非常重要的作用,PLP不仅是通过吡啶氮以及5′-磷酸酯基团以离子键形式与活性中心相连,而且PLP以醛基与酶蛋白上赖氨酸的ε-氨基形成西佛碱,见图2,这些作用力造成PLP与需要PLP作为辅酶的酶之间特异亲和力。因此,固定化PLP不仅作为需要PLP作为辅因子的酶的固定化;而且可以用来提纯酶蛋白,并可进一步探讨结构-功能关系。通过固定色氨酸酶柱和乳酸脱氢酶系统的偶联作用,以NADH在340 nm处光吸收值降低来定     

人α_1型基因工程干扰素的中间试制

带有杂交质粒pBV867的大肠杆菌BMH 71-18株,用高密度发酵培养法进行发酵,3批中试的平均菌产量为100.25克/升,粗制干扰素的表达量平均为8.39mg/升。3批粗制干扰素的数量分别为35000,30000和36000 ml。经初步提纯,分别浓缩10.4、10和11.29倍,比活性上升10、33和30倍,初步提纯的得率为34.33％。经高度提纯、浓缩23.8、16.7和26.1倍,比活明显增加至24.38、20.80和21.43×10~6 IU/mg蛋白,平均得率为35.92％,总得率为11.82％,平均提纯倍数为1757倍。 3批中试产品按WHO规程的标准进行检定,经SDS-PAGE银染色法测定,呈一条带,其分子量约为21000,无论在还原或非还原的条件下干扰素纯度均在95％以上。用HPLC检定均为单一峰形,纯度在95％以上。其它检定项目如等电聚焦、效价、热原、残余DNA、鼠IgG含量测定和全波长扫描等均合乎规程要求。