狂犬病病毒CVS-11株全基因序列测定及分析

目的对狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11株进行全基因序列测定,并就主要抗原位点与我国现用狂犬病疫苗生产毒株进行比较,评价CVS-11株作为抗狂犬病病毒中和抗体检测毒株的适用性。方法将CVS-11全基因组RNA分成8段进行RT-PCR扩增,分别将产物克隆入pGEM-TEasy载体中,测定全序列;用DNAStar软件包中的相应软件对基因全序列进行分析,并与5株生产用狂犬病病毒(CTN-1、aG、FluryLEP、PM和PV)进行基因比对分析和主要抗原位点比较。结果 CVS-11株基因组全长11927bp,其结构基因排列与已知其他狂犬病病毒相同,但G和M基因的非编码区偏长。CVS-11株与我国现用疫苗株的序列同源性在84.3%～99.5%之间。以相对保守的N基因作进化树分析,CVS-11株与PM株同源性最高,与CTN-1和aG株的亲缘关系较其他疫苗株远。各毒株G蛋白抗原位点存在一定的氨基酸差异。结论 CVS-11株与我国现用疫苗株具有较高的同源性;CVS-11株与不同疫苗株G蛋白抗原位点的差异可能对不同疫苗免疫效果评价产生不同程度的影响。     

狂犬病暴露后动物免疫模型的应用进展

目前,狂犬病疫苗采用先免疫后攻毒的暴露前免疫方法来判定狂犬病疫苗的有效性,这与该疫苗在人体的实际应用是先感染后免疫的暴露后免疫不符,因此无法真实体现疫苗对暴露后免疫的有效性。本文对狂犬病疫苗中的灭活疫苗、减毒活疫苗、DNA疫苗及佐剂灭活疫苗的暴露后免疫效果作一综述。采用暴露后免疫评价狂犬病疫苗的有效性,符合该疫苗在人体暴露后免疫的实际应用,更客观真实,也将促进狂犬病疫苗质量的提高,加速狂犬病新型疫苗的研发。     

狂犬病病毒减毒株CTN-181的免疫原性

目的评价狂犬病病毒减毒株CTN-181的免疫原性。方法用不同病毒滴度的CTN-181株病毒对小鼠分别进行口腔或肌肉免疫,14 d后,分别用狂犬病病毒CVS株进行脑内或肌内攻毒,14 d后,计算小鼠的免疫保护力;同时于免疫后14、21和30 d,采用RFFIT法检测小鼠血清抗狂犬病病毒中和抗体水平。结果两种途径免疫的小鼠均产生了较强的保护作用和较高的中和抗体水平。口腔免疫后脑内和肌内攻毒的50%保护剂量分别为1.4×105和1.4×104PFU/ml;肌肉免疫后脑内和肌内攻毒的50%保护剂量分别为1.4×106和1.4×105PFU/ml。小鼠口腔免疫CTN-181病毒量≥1.4×105PFU/ml 14 d后,即可产生有效的保护,至30 d时,1.4×106和1.4×107PFU/ml剂量组中和抗体水平达20 IU/ml以上;肌内免疫产生的中和抗体水平较低。结论 CTN-181减毒株具有良好的免疫原性,以较低病毒量免疫小鼠即可产生高水平的中和抗体和保护作用。     

狂犬病病毒aG株糖蛋白遗传稳定性及生物信息学分析

目的研究狂犬病病毒(rabies virus,RV)aG株糖蛋白(glycoprotein,GP)的遗传稳定性,并对GP基因组进行序列测定及生物信息学分析。方法采用RT-PCR法扩增6代次aG株RV(4aGV4、4aGV5、4aGV7、4aGV11、4a-GV15、4aGV18)G区基因,分别将产物克隆入pGEM-T载体中,测定序列并进行拼接;测定6代次aG株RV的滴度、荧光滴度和毒力;应用DNAStar和Mega4.0软件包中的相应软件对基因组序列进行分析,并与我国近期分离且具有地域代表性的RV街毒株进行基因同源性分析。结果 6代次aG株RV GP基因保持高度稳定,未出现核苷酸突变位点;6代次aG株RV的滴度有所不同,但其毒力指标基本一致;RV aG株与我国街毒流行株GP抗原区具有较高的同源性,且膜外区同源性远高于跨膜区及膜内区;aG株RV第147位关键位点氨基酸与街毒流行株该位点不同,其余各关键抗原位点在各毒株间均高度同源;6代次aG株RV关键毒力位点均未出现氨基酸突变,传代稳定,aG株RV与各街毒流行株关键毒力位点均高度同源;aG株病毒信号肽结构与我国多株流行株高度同源,而其GP则与法国巴斯德原株PV2061株及分离自美国的HEP-Flury株高度同源,与我国流行街毒株亦具有较高的同源性。结论 RV aG株GP遗传稳定,且与我国近期分离的街毒株高度同源,本研究为完善该毒株的质量控制及全面评价其在我国的适用性提供了实验依据。     

狂犬病病毒核蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达、纯化狂犬病病毒(Rabies virus,RV)核蛋白(Nucleoprotein,NP),并检测其免疫原性。方法 RT-PCR扩增RV CVS-11株NP全长基因序列,克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组原核表达质粒pET-30a-N,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经Ni2+柱亲和层析纯化后,进行Western blot分析,并分别以A(lOH)3和CpG1826作为佐剂经腹腔免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠的血清特异性抗体水平。结果重组原核表达质粒pET-30a-N经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约51 800,表达量约占菌体总蛋白的35%,主要以包涵体形式存在;纯化的重组蛋白纯度达90%以上,可与抗RV小鼠血清特异性结合,分别以A(lOH)3和CpG1826作为佐剂免疫小鼠的血清特异性抗体滴度对数的GMT值(3.81±0.22和3.68±0.20)明显高于阴性对照组(1.25±0.22),且差异均有统计学意义(P<0.01)。结论已成功表达并纯化了RV NP,其免疫原性良好,为进一步研究其功能奠定了基础。     

第九批人用狂犬病疫苗国家标准品的协作标定

目的 对制备的第九批候选人用狂犬病疫苗国家标准品的效价进行协作标定，并最终赋值。方法 组织人用狂犬病疫苗生产、研发等有资质的实验室，以第七批狂犬病疫苗国际标准品(NIBSC代码：16/204)为检测标准品，采用NIH法对候选狂犬病疫苗国家标准品进行效价测定。对协作标定单位的检测结果进行统计学分析，取有效检测值的几何均值作为候选标准品的最终效价值。根据国家药品标准物质制备的要求，对该候选标准品进行热加速破坏后检测糖蛋白抗原，考察其稳定性。结果 参加协作标定的单位有20家，剔除未严格按照协作标定SOP操作的2家，剩余协作单位数据均有效，经统计学分析，第九批狂犬病疫苗国家标准品效价最终赋值为11.4 IU/mL,95%可信限为10.9～11.9 IU/mL,ED₅₀的95%参考范围为2.10～2.75。37℃放置不同时间(2、4、8和16周)糖蛋白抗原检测结果未见明显差异。结论 完成了第九批候选人用狂犬病疫苗国家标准品(批号：201906001)的协作标定，其效价赋值科学、严谨、数据可靠，热稳定性符合要求。目前该标准品已获得国家药品标准物质委员会批准使用，对人用狂犬病疫...