新型狂犬病病毒中和抗体检测方法的建立

目的建立一种安全、快速、经济的新型狂犬病病毒中和抗体的检测方法。方法在狂犬病病毒弱毒株HEP-Flury基因组Ψ区插入增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein eGFP)基因,利用反向遗传技术,拯救重组病毒rHEP-eGFP,分别采用荧光显微镜观察、直接免疫荧光染色鉴定及电镜观察等方法对rHEP-eGFP病毒进行鉴定;分别绘制rHEP-eGFP和亲本毒株HEP-Flury的生长动力学曲线;将rHEP-eGFP在BHK-21细胞中连续传代9次,测定各代次rHEP-eGFP的滴度,荧光显微镜下观察eGFP的表达;采用TCID50法检测狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11和rHEP-eGFP的毒力;以rHEP-eGFP病毒为抗原,建立新型荧光抗体病毒中和试验(fluorescent antibodyvirus neutralization,FAVN)-eGFP,对25份犬血清的抗体效价进行测定,并与标准FAVN检测结果进行比较。结果经荧光显微镜观察、直接免疫荧光染色鉴定和电镜观察表明,成功拯救出rHEP-eGFP病毒;重组病毒rHEP-eGFP与亲本病毒HEP-Flury的生长特性相似;rHEP-eGFP连续传代9次,均能稳定表达eGFP;CVS-11的毒力为108TCID50/ml,rHEP-eGFP的毒力为107.3TCID50/ml;FAVN-eGFP与FAVN测定25份犬血清抗体效价的结果具有良好的一致性。结论建立的新型狂犬病病毒中和抗体检测方法(FAVN-eGFP)准确度高,特异性好。     

东方马脑炎病毒E2蛋白的表达、纯化及免疫原性

目的表达、纯化东方马脑炎病毒(eastern equine encephalitis virus,EEEV)E2蛋白,并检测其对小鼠的免疫原性。方法利用IPTG诱导重组大肠埃希菌BL21-pET30-EEEV-E2,表达E2蛋白,用包涵体纯化试剂盒纯化重组E2蛋白,进行SDS-PAGE和Western blot分析。将BALB/c小鼠随机分为4组:PBS对照组、弗氏佐剂对照组(弗氏佐剂与PBS按体积比1∶1乳化)、E2蛋白组(E2蛋白与PBS按体积比1∶1混合)和E2蛋白+弗氏佐剂组(E2蛋白与弗氏佐剂按体积比1∶1乳化),每组10只,各组均经小鼠后肢肌肉免疫3次,两次免疫间隔时间均为14 d,免疫剂量均为100μl/只。第2次免疫后第7天,采用流式细胞术检测小鼠体内CD4+和CD8+T细胞比例;第2次免疫后第14天,采用细胞因子ELISA定量试剂盒检测小鼠血清中IL-2、IL-4和IFNγ的含量;第3次免疫后第7天,采用MTT法检测小鼠淋巴细胞增殖情况;每次免疫后第14天,采用ELISA法检测小鼠血清中IgG抗体效价。结果表达的重组E2蛋白相对分子质量约为53 000,表达量为菌体总蛋白的26.3%;纯化的重组E2蛋白纯度达95%以上;表达和纯化的重组E2蛋白均可与鼠抗His标签单克隆抗体结合。与PBS对照组、弗氏佐剂对照组和E2蛋白组相比,E2蛋白+弗氏佐剂组小鼠体内CD4+与CD8+T细胞比值、血清中IL-2、IL-4和IFNγ浓度、体内淋巴细胞增殖指数均明显升高(P﹤0.01);小鼠初次免疫后即可产生E2蛋白IgG抗体,且随着免疫时间的延长,抗体效价逐渐上升,第3次免疫后第14天,抗体效价可达1∶320。结论表达并纯化了重组E2蛋白,其能使小鼠产生较强的免疫反应,为新型EEEV疫苗的研制提供了参考。