杨树菇中一种脱氧核糖核酸酶的纯化及其性质

目的分离纯化杨树菇子实体中脱氧核糖核酸酶,并对其性质进行分析。方法通过80%饱和(NH4)2SO4沉淀、Blue Sepharose 6 Fast Flow、DEAE-Sepharose Fast Flow和SP-Sepharose Fast Flow层析方法,从杨树菇子实体中分离纯化一种脱氧核糖核酸酶。SDS-PAGE和活性SDS-PAGE测定相对分子质量,采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法分析其酶学性质,并检测pH、温度、Mg2+和EDTA浓度对酶活性的影响。结果经纯化得到了一种脱氧核糖核酸酶,其相对分子质量为31000。该酶对超螺旋质粒DNA、λDNA、ssDNA和dsDNA均具有降解活性,对dsDNA的降解活性略高于ssDNA,且酶活性依赖于二价金属阳离子。该酶的最适pH值范围为7.5～9.6,50℃时相对酶活性最高。结论从杨树菇子实体中纯化的脱氧核糖核酸酶属于一种非限制性脱氧核糖核酸内切酶。     

水稻瘤矮病毒S3和S8基因共表达杆状病毒转移载体构建及重组病毒的鉴定

为构建携带水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)主要内层衣壳蛋白S3基因和外层衣壳蛋白S8基因的重组杆状病毒,将目的基因(S3和S8)分别亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual多角体启动子(PH)和p10启动子的下游.经酶切和确证性序列测定,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,获得重组杆粒rbpFBDS3-S8,采用脂质体转染法,将rbpFBDS3-S8转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞包装病毒,PCR筛选鉴定重组病毒.结果表明:Sf9昆虫细胞被侵染72 h后,倒置显微镜下观察到细胞增大,培养液和细胞内出现颗粒状物质,部分细胞破裂甚至裂解,说明S3和S8基因已整合到重组杆状病毒基因组中,这为开展RGDV主要结构蛋白在昆虫细胞中的表达及其功能研究奠定了基础.     

多杀菌素·毒死蜱微球高效液相色谱分析

[目的]建立了在同一液相色谱条件下测定多杀菌素和毒死蜱的定量分析方法。[方法]以甲醇-乙腈-0.05%乙酸钠溶液(体积比45∶45∶10)为流动相,流速为1.0 mL/min,使用Amethyst C18-H色谱柱,紫外波长检测器,柱温为20℃,选择250 nm为检测波长进行检测。[结果]方法对于多杀菌素和毒死蜱组分的标准偏差分别为0.0541、0.070 1,变异系数为0.621%、0.578%,平均回收率为97.45%、100.03%,线性相关系数为0.999 9、0.999 7。[结论]该方法具有简便、快捷、分离效果好、精密度和准确度高、线性关系好的特点。     

芯壁材比对多杀菌素微球质量的影响

[目的]得到芯壁材的最佳比例,为后续的多杀菌素微球制备工艺优化提供基础.[方法]采用乳化-溶剂挥发法,以聚乳酸(PLA)为成球材料制备多杀菌素微球.研究了不同芯壁材比对多杀菌素微球形态、粒径大小和包封率的影响规律.[结果]随着多杀菌素在微球中所占比例越大,多杀菌素越容易在微球表面形成不规则的结晶.[结论]芯壁材的最佳比例为不大于1∶2.     

马铃薯X病毒CP基因的原核表达及特异性抗血清的制备

依据马铃薯x病毒(Pottato virus X，PVX)外壳蛋白(CP)基因序列(711bP)设计合成了两对引物，通过RT—PCR扩增得到长0．7bp的目的片段．将目的片段转入大肠杆菌，酶切鉴定证明得到了含有目的片段的重组子，测定序列结果与其他PVx分离物CP基因序列比较，发现其核苷酸同源性最高可达99％左右，证明此病毒为PVX．构建了含PVx CP基因的融合蛋白原核表达载体，并在大肠杆菌中得到表达，SDS—PAGE测定该融合蛋白GST—xCP的相对分子质量为52000．Westem blot分析结果显示，GST—XCP与PVX抗血清有很强的免疫反应，表明GST—XCP有天然状态下病毒核衣壳蛋白的抗原性、制备了GST—xCP抗血清，并利用此抗血清建立了PVx的间接ELISA检测方法，检测灵敏度为1mg鲜重的病株叶片．     

烟草花叶病毒强、弱毒株对烟草植株的影响

分别接种烟草花叶病毒强毒株（TMV-W）、诱变获得的两个弱毒株（TMV-017、TMV-152）于普通烟（品种为K326）。间接ELISA法测定了强，弱毒株在接种叶上的增殖速率，同时考察了叶绿素a、叶绿素b，叶绿素，可溶蛋白含量的变化。实验发现强毒株在接种后第2d就可检测到，而弱毒株在第3d被检测到，弱毒株在烟草植株体内的稳定浓度低于强毒株，分别受强，弱毒株侵染的烟草叶片中的叶绿素a,叶绿素b，叶绿素含量都有所下降，但强毒株引起的下降幅度最大。受强，弱毒株分别侵染的烟叶中可溶性蛋白含量均发生变化，初期都有所升高，之后，弱毒株随着侵染时间的延长而有所下降，而强毒株下降后又有所回升。     

乳化剂和共乳化剂对甲维盐水乳剂乳液稳定性的影响

在筛选出合适的乳化剂和共乳化剂的基础上,研究了乳化剂亲水亲油平衡值(HLB)、含量以及共乳化剂含量对1%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐水乳剂乳液体系稳定性的影响,以及乳化剂在54℃热贮2周的稳定性.结果表明,乳化剂的HLB可以为水乳剂的乳液稳定性提供参考依据,乳液的粒径和表面张力随着乳化剂含量的升高而减小,当乳化剂含量增大到一定程度后,粒径和表面张力开始趋于稳定.共乳化剂对水乳剂的粒径没有太大影响,但可以显著降低水乳剂的表面张力,增强体系的稳定性.水乳剂乳液粒径和表面张力在一定范围内可以反映出乳液体系的稳定性,当粒径和表面张力变小时,乳化剂HLB、含量或共乳化剂含量能够满足热贮稳定性,则此时乳化剂或共乳化剂种类及含量为最佳.     

甲氨基阿维菌素苯甲酸盐水乳剂的研制

以水乳剂粒径、表面张力、分散性、热贮稳定性、低温稳定性等为质量指标,采用高剪切制乳法研究了不同溶剂、乳化剂、共乳化剂、增稠剂、防冻剂对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐水乳剂的影响.最终确定甲氨基阿维菌素苯甲酸盐水乳剂的最佳配方为0.01 g·mL-1甲氨基阿维菌素苯甲酸盐原粉、体积比为9:1的二甲苯和甲苯(体积分数为9%)、1%(体积分数)正丁醇、4.2%(体积分数)EL-60、1.8%(体积分数)ZS1640、1%(体积分数)十二烷醇、0.05%(体积分数)黄原胶和2%(体积分数)乙二醇.甲氨基阿维菌素苯甲酸盐水乳剂经54℃热储2周后,对小菜蛾的毒力与1%甲维盐乳油的相当.     

马铃薯X病毒CP基因的原核表达及特异性抗血清的制备

依据马铃薯X病毒(PotatovirusX,PVX)外壳蛋白(CP)基因序列(711bp)设计合成了两对引物,通过RT-PCR扩增得到长0.7bp的目的片段.将目的片段转入大肠杆菌,酶切鉴定证明得到了含有目的片段的重组子,测定序列结果与其他PVX分离物CP基因序列比较,发现其核苷酸同源性最高可达99%左右,证明此病毒为PVX.构建了含PVXCP基因的融合蛋白原核表达载体,并在大肠杆菌中得到表达,SDS-PAGE测定该融合蛋白GST-XCP的相对分子质量为52000.Westemblot分析结果显示,GST-XCP与PVX抗血清有很强的免疫反应,表明GST-XCP有天然状态下病毒核衣壳蛋白的抗原性.制备了GST-XCP抗血清,并利用此抗血清建立了PVX的间接ELISA检测方法,检测灵敏度为1mg鲜重的病株叶片.