白细胞介素2(~(125)Ser)在昆虫细胞中的高效表达

目的　高效表达白细胞介素 2 (12 5Ser)。方法　采用新型Bac -to -Bac杆状病毒表达系统 ,以PCR技术扩增了人白细胞介素 2 (12 5Ser)的基因片段 ,将其克隆到转座载体 ,经转座作用将白细胞介素 2 (12 5Ser)基因插入杆状病毒穿梭载体 ,在昆虫细胞中表达。结果　通过免疫印迹实验及CTLL - 2细胞 /MTT法检测 ,表达产物具有人白细胞介素 2的免疫学及生物学活性。经SDS -PAGE电泳 ,薄层扫描分折 ,表达量达到了 2 3.47%。结论　白细胞介素 2 (12 5Ser)在昆虫细胞中获得了高效表达。     

乙型脑炎病毒E蛋白毒力关键位点的正向验证

目的将乙型脑炎野毒株SA14囊膜蛋白(envelope,E)氨基酸残基107位点(E107)和138位点(E138)突变为乙型脑炎减毒株SA14-14-2的相应位点,正向分析两个氨基酸位点突变在乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)减毒中的作用。方法通过融合PCR方法分别扩增含有E107(1296-T)、E138(1389-A)、E107+138(1296-T/1389-A)突变位点的PCR片段,KasⅠ和BglⅡ酶切后替换乙型脑炎强毒SA14的嵌合病毒SA14-14-2/SA14的相应区域,构建3个突变株病毒的全长克隆,转染BHK21细胞获得突变株病毒。测定并比较3个突变株和嵌合病毒SA14-14-2/SA14、疫苗株SA14-14-2的蚀斑大小及细胞增殖特征、小鼠脑内神经毒力、小鼠皮下感染入脑能力,分析E107、E138位点突变对JEV的减毒作用。结果测序结果表明成功构建了3株突变株病毒,其中E107单位点突变对小鼠脑内神经毒力和皮下感染入脑能力无显著改变,蚀斑形态和细胞增殖能力也无明显变化。E138单位点突变及E138和E107双位点突变使病毒脑内神经毒力和皮下感染入脑能力急剧降低,其中E138和E107双位点突变使病毒皮下感染入脑能力完全消失,并且E138单位点突变以及E138和E107双位点突变病毒蚀斑较疫苗株SA14-14-2和嵌合病毒SA14-14-2/SA14明显偏小,但增殖能力有明显升高。结论 E138位点突变对JEV SA14的减毒起关键作用;在E138位点突变的前提下,E107位点与E138位点有显著的协同作用。     

重组人活性蛋白C的基因克隆、表达载体构建以及在哺乳动物细胞中的高效表达

目的研究重组人活性蛋白C的基因克隆、表达载体构建以及在哺乳动物细胞中的表达。方法用RT-PCR法从人胎肝中克隆出人蛋白C轻重链基因,用PCR突变法获得人活性蛋白C的全基因,将所得全基因连接入哺乳动物细胞表达载体,并转染293细胞研究其表达和活性。结果成功得到重组人活性蛋白C基因,并成功构建哺乳动物细胞表达载体和转染293细胞获高效表达以及相关活性数据。结论通过以上方法可以获得重组人活性蛋白C基因,并实现了在哺乳动物细胞中的高效表达。     

比浊法检测疫苗中TritonX-100残留量的方法学验证

目的建立检测疫苗中Triton X-100残留量的比浊法,并进行方法学验证。方法将TritonX-100与5%苯酚溶液充分混匀后,室温静置15 min,采用比浊法测定340 nm处吸光度值,与经同样处理的标准品绘制的标准曲线比较,计算样品中残留TritonX-100的浓度。由4名试验人员连续3 d测定12次,评价不同试验人员建立标准曲线的成功率;由同一试验人员在同一试验内和不同时间内及由4名试验人员在不同时间内分别测定低(15μg/ml)、中(25μg/ml)、高(45μg/ml)3个不同浓度的TritonX-100的浓度,验证该方法的精密度和准确度;并检测BSA对试验准确度和精密度的影响。结果 4名试验人员连续3 d的12次检测结果均满足标准曲线的成立条件,成功率为100%;同一试验人员在同一试验内对低、中、高3个不同浓度的TritonX-100溶液重复测定10次,变异系数分别为分别为5.33%、1.19%和1.39%,回收率分别为99.33%、105.60%和110.67%;同一试验人员在不同时间内连续测定3次,变异系数分别为4.94%、7.49%和3.46%,回收率分别为87.75%、93.85%和95.51%,4名试验人员在不同时间内连续测定3次,变异系数在1.73%~12.17%之间,回收率在89.55%~99.26%之间,灵敏度为10μg/ml,具有良好的精密度和准确度;BSA对试验准确度和精密度无显著影响。结论该方法快捷、简便,可灵敏、准确地定量检测TritonX-100的含量,可用于疫苗样品中残留TritonX-100的质量控制。     

治疗用卡介苗对MB49膀胱肿瘤细胞增殖的影响

目的探讨治疗用卡介苗(简称BCGt)对MB49膀胱肿瘤细胞(简称MB49细胞)增殖的影响。方法体外培养MB49细胞,每天观察并采用CCK-8法检测细胞生长情况,绘制细胞生长曲线。取对数生长期的MB49细胞与不同浓度(20、15、10、8、6、3、2. 5、2、1. 5、1 mg/mL)的BCGt作用72 h,CCK-8法检测细胞增殖能力,计算细胞抑制率。同时采用ELISA法测定细胞培养液中IL-6、IL-8及IL-15的浓度。结果 MB49细胞于第1～4天处于对数生长期,细胞增殖速度较快,细胞形态正常。BCGt可有效抑制MB49细胞的增殖,且呈剂量依赖性,IC_(50)为3. 650 mg/mL。经BCGt作用后细胞培养液中IL-6和IL-15浓度明显增高(P 0. 05),IL-8浓度未发生明显变化(P 0. 05)。结论BCGt可抑制MB49细胞的增殖,可能是通过提高IL-6和IL-15的水平,促进细胞免疫应答,从而发挥抗肿瘤作用的。     

狂犬病病毒PM株病毒滴度检测改良蚀斑法的建立

目的建立检测狂犬病病毒PM株病毒滴度的改良蚀斑法,并验证其精密度。方法于细胞接种病毒后第6天,分别加入不同浓度(0、50、75、100、200、400 mmol/L)HEPES溶液,以及分别于细胞接种病毒后第2、4、6、8天,加入最适浓度的HEPES溶液,确定HEPES最适加入浓度及蚀斑最适判定时间,建立改良的蚀斑法,检测48批狂犬病病毒毒力,并与小鼠脑内滴定法进行相关性比较;重复检测3次10批狂犬病病毒收获液毒力,计算变异系数(CV)。结果接种病毒后第6天后加入200 mmol/L HEPES溶液,形成的蚀斑清晰,易于计数。建立的蚀斑法与小鼠脑内滴定法具有高度相关性,3次检测结果的CV在0. 4%～3. 38%之间,重复性良好。结论加入HEPES溶液改良后的蚀斑法,操作便捷,是较为理想的滴定狂犬病病毒PM株毒力的方法,可替代小鼠脑内滴定法。     

治疗用卡介苗在膀胱癌预防及治疗中的作用

目的探讨治疗用卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin vaccine for treatment,BCGt)在膀胱癌预防及治疗中的作用。方法 MB49细胞灌注小鼠膀胱,建立小鼠原位膀胱癌模型,进行BCGt预防性和治疗性试验,观察小鼠生存情况。末次治疗后第6天,经小鼠眼球采血,检测血清中IgG、IFNγ和IL-6的含量,同时取小鼠脾脏,检测特异性T淋巴细胞;每次治疗后检测小鼠尿液中一氧化氮(NO)含量;末次治疗45 d后进行记忆性免疫试验。结果成功建立了基于MB49细胞的小鼠原位肿瘤模型,致癌率100%。BCGt免疫预防和治疗两种方式均可延长小鼠的生存期;BCGt治疗后小鼠血清中的IgG、IFNγ、IL-6及尿液中NO含量明显升高(P 0. 05),特异性T淋巴细胞反应明显增强(P 0. 001),且可产生免疫记忆。结论 BCGt具有预防及治疗膀胱癌的作用,且BCGt抗肿瘤作用可能是通过产生IFNγ、IL-6、NO等发挥作用的。     

寨卡病毒E蛋白第三结构域的可溶性表达及多克隆抗体的制备

目的原核表达并纯化寨卡病毒(Zika virus)E蛋白第三结构域(ZK-EⅢ)重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法 PCR扩增ZK-E Ⅲ序列,经双酶切后将其插入原核表达载体p ET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-ZKE Ⅲ,转化至大肠埃希菌(E. coli)Rosetta2(DE3),经IPTG诱导,表达的重组蛋白经亲和层析和阴离子交换层析纯化后,免疫家兔,制备ZK-E Ⅲ多克隆抗血清,进行Western blot鉴定后,ELISA法检测该抗血清效价。结果经PCR及测序鉴定证明原核表达质粒pET-ZKE Ⅲ构建正确,表达的重组蛋白相对分子质量约31 000,主要以可溶性形式存在,表达量占菌体总蛋白的60%;用纯化的重组蛋白免疫家兔后,获得的血清特异性良好,血清效价为1∶51 200。结论 ZKE Ⅲ蛋白在E. coli中以可溶性形式表达,制备的抗血清特异性好,效价高,具有用于寨卡病毒诊断和进行重组亚单位疫苗开发的潜力。