肠膜明串珠菌ATCC 12291蔗糖磷酸化酶的酶学性质及转糖苷分子改造

根据GenBank数据库公布的肠膜明串珠菌ATCC 12291中蔗糖磷酸化酶基因序列,构建重组表达质粒pQE-lmsp。在大肠杆菌Escherichia coli M15/pREP4中诱导表达,镍亲和层析纯化蛋白,进行酶学性质测定和重组酶转糖苷活性的研究。以蔗糖为底物对LMsp进行酶学性质分析,其最适温度和最适pH值分别为40 ℃和6.5;Km值和Vmax值分别为（34.16±1.219）mmol/L和（370.5±6.049）μmol/（mg·min）。当以葡萄糖-1-磷酸为供体时,对于大多数单糖及其糖醇类受体均具有转糖苷活性,尤其对L-阿拉伯糖具有75%的转化效率。然后通过对LMsp进行同源建模和氨基酸序列比对分析,进行分子改造,并比较酶学性质及转糖苷活性的变化。获得7 个单点和联合的突变体T180A、T219V、P236S、T180A-T219V、T180A-P236S、T219V-P236S、T180A-T219V-P236S,其中突变体T180A、P236S对L-山梨糖的转糖苷活性分别有13.7%和15%的提高。本研究通过对LMsp的研究,发现其具有良好的酸碱稳定性和对L-阿拉伯糖的高转糖苷活性,并且获得了对于L-山梨糖转糖苷活性提高的突变体,丰富了有关于蔗糖磷酸化酶的性质,并且对该酶的分子改造提供了经验依据。