猪流行性腹泻病毒冻干qLAMP检测体系的建立

为建立猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）实时荧光定量LAMP（Quantitative LAMP,qLAMP）与冻干技术结合的快速检测方法。该实验根据PEDV的高度保守序列设计了引物并进行筛选,建立PEDV的qLAMP检测方法。筛选棉子糖、甘露醇和牛血清蛋白作为冻干辅料并优化,将最佳的配方与等温扩增试剂（除甜菜碱）混合后进行冷冻干燥处理。优化主干燥升温方式和二次干燥时间,制作出一条适合等温扩增试剂的冻干曲线,并以此制备PEDV qLAMP冻干检测试剂盒。结果显示：通过对冻干成品性状、溶解性及剩余水分含量的测定,确定了主干燥后期采用一步升温的方式进行升温,解析干燥时间为3.5 h。PEDV qLAMP冻干检测体系的最低检测限为每微升157 copies,与工艺优化前相比,其检测速率得到提升。对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒等5种病原无扩增反应,重复性实验变异系数均小于5%,常温条件下保存30 d,在4 ℃条件下至少保存12个月。该研究通过使用冻干技术建立了LAMP检测方法,具有现场操作简便快捷、检测效果好、储存时间长,适用于基层现场快速检测。