732阳离子交换树脂对全细胞谷氨酸脱羧酶活性的促进机制

通过对全细胞和纯酶的对比分析,从732阳离子交换树脂对细胞转化体系pH、产物效应和底物效应的影响,对732阳离子交换树脂促进屎肠球菌全细胞谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD,EC4.1.1.15)活力的机制进行了探讨。结果显示:γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)对全细胞GAD活性具有抑制作用,而L-谷氨酸(L-glutamic acid,L-Glu)却无此现象,并且当L-Glu浓度达到200 mmol/L以上时,全细胞GAD活性才达到最大;在pH4.2~5.8条件下,GABA解离为阳离子较L-Glu多,可与树脂平衡时所结合的L-Glu和H+发生离子交换,补充游离L-Glu,减少游离GABA,稳定反应体系pH。研究表明,732阳离子交换树脂可以通过离子交换作用而释放H+、L-Glu和结合GABA,增加反应液游离底物浓度和降低游离产物浓度,并调节反应液pH,增大细胞内外浓度差,加快细胞内外物质运送速度,从而提高全细胞GAD的表观活力。     

屎肠球菌源谷氨酸脱羧酶的制备及其酶学性质研究

为了开发谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD),以Enterococcus faecium为gadB基因供体、纤维素结合域(cellulose-binding domain,CBD)为亲和标签,利用内含肽DnaB自剪切作用分离GAD,对融合酶CBD-DnaB-GAD的构建、表达、GAD纯化及其酶学性质进行了探讨。结果表明:重组Escherichia coli GDMCC60446可高效表达CBD-DnaB-GAD,适宜自剪切液为0.2 mol/L Na₂HPO₄-NaH 2PO₄缓冲液(pH 6.5,含NaCl 0.5 mol/L、EDTA 1 mmol/L);经一步纯化和自剪切制备的GAD在SDS-PAGE电泳上呈单一条带,分子质量约为55.68 kDa,仅有1个亚基;GAD最适反应pH和温度分别为5.0和55℃,在pH 4.8~5.8和-25~55℃较稳定;5 mmol/L的NaCl、CaCl₂和乙二醇对GAD酶活力影响不大,而KCl、EDTA-2Na、ZnSO₄、CuSO₄、MnSO₄、MgSO₄、FeCl₂、FeCl₃、AlCl₃、AgNO 3和Pb(CH₃COO)₂对GAD酶活力具有不同程度的抑制作用;GAD仅催化L-谷氨酸发生脱羧反应,K m和V max分别为10.51 mmol/L和3.41μmol/(mL·min),催化反应无底物和产物抑制作用。GAD纯度和酶学性质优良,制备工艺简便,该技术有望应用于工业化生产。