转录因子MSN2基因过表达对酿酒酵母耐受性的影响

cAMP信号通路在调控酵母细胞代谢、增殖、分化及压力抗性的获得过程中具有重要的作用。工业应用中对酵母的耐受性有很高的要求,在发酵过程中,胁迫环境如高温、高渗透压、营养饥饿和高浓度酒精毒性等不可避免,故而提高酵母菌种的耐受性,可以提高菌种的发酵性能,降低发酵过程中的能量消耗。本文构建的突变株在工业应用方面具有重要的意义。以实验室现有菌种AY12a为出发菌株,URA3基因作筛选标记,利用胞内重组,在MSN2基因的N端加上强启动子PGK1_p以实现基因的过表达,最终通过PCR验证,成功构建突变株AY12a-msn2。对酵母进行耐受性的测定,发现AY12a-msn2不具有一定的耐高温性能。同时将突变株与AY12a进行玉米高温浓醪发酵,并测定发酵完成后的酒度、残糖、48 h细胞存活率、CO_2失重及发酵时间。结果发现突变株AY12a-msn2酒度下降,残糖含量上升,48 h细胞存活率上升,发酵时间较长。     

GIS1基因对酿酒酵母耐受性的研究

该研究主要通过过表达GIS1基因来提高酿酒酵母的耐受性。在GIS1基因的N端加入强启动子PGK1p来实现GIS1基因的过表达,然后通过稀释点板实验来对比其对热激、乙醇、渗透压以及乙酸的耐受性,同时通过高温生长曲线和高温浓醪发酵测定其高温耐受性。结果表明,在相同的稀释倍数下,55 ℃热击4 min之后菌株AY12a-gis1的生长能力明显优于出发菌株,在含有5%（V/V）乙酸的平板上改造菌和出发菌耐受性相差不大,同时通过38 ℃浓醪发酵实验发现菌株AY12a-gis1的酒精度提高了3.79%,残糖略有下降,且发酵时间与亲本菌株相一致。因此通过过表达GIS1基因得到菌株AY12a-gis1,是对工业乙醇发酵有一定应用价值的优良耐逆性菌株。     

TPK3基因敲除对酿酒酵母耐受性的影响

酿酒酵母是乙醇发酵时常用的微生物,在发酵过程中会受到高温、乙醇、渗透压、乙酸等胁迫环境的影响。为增强酵母对胁迫环境的耐受,该试验以AY12a为出发菌株,利用胞内同源重组,敲除编码蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）催化亚基的TPK3基因,构建TPK3基因敲除菌株AY12a-2。利用敲除TPK3基因的分子操作来调控PKA活性,以此来提升酵母耐受性。耐受性测定结果表明,该菌株的耐热击性能、耐乙酸性能及耐盐性明显优于出发菌株。发酵数据表明,AY12a-2的葡萄糖消耗量增加及CO2的失重量提升34%,乙醇产量增长了17.8%。     

MSN4基因的过表达对酿酒酵母耐受性的影响研究

以实验室现有菌种AY12a为出发菌株,URA3基因作为筛选标记,利用胞内重组,在MSN4基因的N端加上强启动子PGK1p以实现基因的过表达,最终通过多聚酶链式反应（PCR）验证,成功构建突变株AY12a-msn4。结果表明,该突变株具有一定的耐高温性能,在55 ℃条件下热击后仍能正常生长。同时将突变株AY12a-msn4与出发菌株AY12a进行玉米高温浓醪发酵,并测定发酵完成后的酒精度、残糖、48 h细胞存活率、CO2失重及发酵时间。结果表明,突变株AY12a-msn4发酵液酒精度提高3.85%,48 h细胞存活率上升,残糖含量下降14.5%。