蓝圆鲹骨骼肌脯氨酸内肽酶的分离纯化及其对胶原肽的作用

以蓝圆鲹为研究对象,探讨脯氨酸内肽酶(Prolyl endopeptidase,PEP)对鱼类肌肉胶原蛋白的作用及其机理。通过硫酸铵分级盐析,DEAE-Sephacel阴离子交换,Phenyl-Sepharose疏水层析和Q-Sepharose阴离子交换,从蓝圆鲹骨骼肌中分离纯化得到一种脯氨酸内肽酶。SDS-PAGE结果显示,PEP的分子量为82 ku,肽质量指纹图谱分析得到16个肽片段,共169个氨基酸残基。片段序列与墨西哥鲷鱼(Neolamprologus brichardi)PEP的同源性达98.8%,证明纯化得到的酶是PEP。PEP的最适温度为35℃,但热稳定性较差;最适p H为6.0,在p H 5.0~7.5之间有较好的稳定性。将PEP与合成的鱼胶原蛋白小肽反应,利用反相高效液相色谱对产物进行分离,电喷雾质谱分析结果显示PEP的水解位点在脯氨酸残基的羧基端。以上结果表明,鱼类肌肉中的PEP能够协同金属蛋白酶,通过切割脯氨酸残基进一步降解胶原小肽从而参与到鱼肌肉胶原蛋白的新陈代谢中,是鱼死后参与胶原蛋白降解的重要酶类。     

凡纳滨对虾组织蛋白酶L性质分析及其对肌肉蛋白的降解

本研究从凡纳滨对虾肝胰腺中纯化获得一种组织蛋白酶L,其分子质量约为31 k D,肽质量指纹图谱分析得到8个片段共112个氨基酸残基,与报道的凡纳滨对虾组织蛋白酶L序列完全一致。该酶的最适温度和最适pH值分别为35℃和5.5,且在0~40℃以及pH 5.5~6.5之间酶活力稳定。该酶仅对底物Z-Phe-Arg-MCA特异分解。半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64和Leupeptin对其有明显的抑制作用,而金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸和乙二醇二乙醚二胺四乙酸对其有少量的激活作用。扫描电子显微镜观察结果显示,随着低温贮藏时间的延长,对虾肌肉纤维的断裂程度不断增加。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示,组织蛋白酶L可使肌肉蛋白发生分解,推测其可能参与对虾低温贮藏过程中肌肉的降解。     

基于近邻评分预测的协同过滤推荐算法

随着用户数量和网站提供的服务种类的不断增加,这些网站都面临着怎样更精准的给自己的用户推荐他们可能感兴趣的东西。传统的在用户—项目评分矩阵上计算项目之间相似性的方法不够精确,而且当用户—项目评分矩阵很稀疏的时候误差很大甚至无法处理。文中在项目评分相似性计算中考虑了时间信息,在计算项目相似性中融合了项目评分相似性和经过加权处理的项目属性特征相似性。实验结果表明,该算法较之传统的方法能够较好的应对数据稀疏问题,同时提高了推荐结果的精确度。     

褶牡蛎氨肽酶B的分离纯化和性质研究

氨肽酶是一类能特异水解蛋白质N端氨基酸残基的外切酶,在食品行业有着广阔的应用前景。以褶牡蛎(Alectryonella plicatula)为原料,通过硫酸铵盐析,DEAE-sepharose,phenyl-sepharose及羟基磷灰石柱层析,分离纯化得到了一种高效水解碱性氨基酸的氨肽酶,其活性能被氨肽酶特异性抑制剂bestatin有效抑制。双向电泳结果显示该酶的分子质量约为100 ku,pI约为5.8。通过肽质量指纹图谱对其进行鉴定得到12个肽段,共含138个氨基酸残基,这些氨基酸序列与太平洋牡蛎中嘌呤霉素敏感性氨肽酶一致,表明纯化的酶为氨肽酶B。褶牡蛎氨肽酶B的二级结构以无规卷曲与反向平行为主,其中无规卷曲占42.6%,反向平行占32.0%。动力学研究获得其K_m和k_(cat)值分别为1.5μmol/L和117.5 s~(-1),k_(cat)/K_m为78.3 L/(μmol·s)~(-1)。在35℃,pH值7.0的条件下,该酶具有最大催化活性,能高效水解氨肽酶底物Lys-MCA和Arg-MCA,释放出游离态的Lys和Arg,推测与牡蛎呈味相关。     

竞争性ELISA检测鱼糜制品中蛋清含量

通过纯化蛋清中主要成分卵清蛋白(ovalbumin,OVA),制备抗OVA多克隆抗体,利用制备的抗体建立鱼糜制品中蛋清定量检测的竞争性酶联免疫吸附测定方法(competitive enzyme linked-immunosorbent assay,c-ELISA)。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳和Western blot结果显示,制备的抗OVA多克隆抗体特异性良好。以热处理的OVA为竞争抗原建立的c-ELISA法检测限为1.82 mg/kg,组内变异系数为3.1%,组间变异系数为7.8%,回收率为87.4%~97.2%,表明建立的方法重复性好,准确性较高。利用建立的方法对6种商品化的鱼糜制品进行检测,发现其蛋清的添加量在2.7~83.5 g/kg之间。本研究为今后鱼糜制品中蛋清含量规范标识的监管提供了重要的技术支持。