生物靶标光敏剂对鸭乙肝病毒的特异结合及杀灭作用研究

目的：利用生物靶标效应的原理，探索一种特异灭活病毒的光化学方法。方法：将针对鸭乙肝病毒（DHBV）设计并人工合成的两条三螺旋结构寡核苷酸（TFO）分别标记8－甲氧基补骨脂素（8－MOP），并将这种复合物（TFO－P）与长波紫外线（UVA）共同作用于血液中的DHBV，通过原代细胞感染、酶联免疫测定、DNA斑点杂交等试验，观察在一定作用条件下，TFO－P对DHBV－DNA的特异结合及其所产生的特异光敏效应对DHBV的灭活程度。结果：DHBV－DNA样品斑点印迹随TFO－P含量的增加明显增强，而同时处理的血液中的白细胞DNA样品斑点印迹无明显增强；在TFO－P的加入量为0.1nmol/ml,UVA照射强度为1800μW/cm^2时，5－20min的UV照射可灭活DHBV1.90-6.4个对数级，灭活病毒的效率显著高于UVA和8－MOP的单独作用时的效果。结论：TFO－P与血液中DHBV－DNA能特异结合，在适宜的处理条件下，所产生的光敏效应能有效灭活血液中的DHBV，灭活滴度可达6个对数级以上。     

非特异光化学反应对人体血液白细胞的影响

为观察非转异光化学反应对血液中白细胞的影响，我们采用NBT染料显色、间接免疫荧光流式细胞仪、Tunel法细胞原位凋亡测定等技术观察了经0.10nmol/ml生物靶标光敏剂（TFO-P)和剂量为0.32-2.16J/cm^2的长波紫外线（UVA，320－380nm)照射后血液中性粒细胞的吞噬功能、 细胞表面白介素－8受体抗原活性，以及白细胞DNA降解等生物效应变化。研究结果表明，当UVA照射剂量为0.54-1.00J/cm^2时，中性粒细胞吞噬功能呈增强趋势，显著高于对照组（P值均＜0.05)，继续增加照射剂量，吞噬功能又逐渐降低，照射剂量为1.62J/cm^2时，吞噬功能与正常组相近似，剂量为2.16J/cm^2时，吞噬功能显著低于对照组（P＜0.01)；在0.54-2.16J/cm^2的照射剂量下，中性粒细胞膜IL－8R的抗原活性一直呈下降趋势，白细胞DNA降解不断增强，分别在照射剂量为1.00J/cm^2和1.62J/cm^2时显著低于对照组（P值均＜0.05)。因此认为，在灭病毒应用剂量下血液中性粒细胞吞噬功能正常或有一定的增强；中性粒细胞的免疫原性降低；白细胞降解凋亡开始显著发生。探索血液及其制品中病毒的灭活方法一直是输血和血液生物制品领域的研究热点和难点，因为其不但要求灭病毒的有效性，珲要求高效率保存血液生物活性成分，这使普通、常用的理化消毒方法不能达到要求。近年来，国内外研究者逐渐对光化学灭病毒效果加以了重视，并进行了大量的试验研究^[1,2,3]，试图通过利用光化学的某些特殊机制，使所产生的系列反应集中作用于含核酸的病毒，尽量减少净化处理过程对血液细胞和生物活性成分的损害。我们曾设计并合成了一种生物靶标光敏剂（补骨脂素与病毒特异核酸片段段连接物，TFO－P），其能与脂质胞膜的试验病毒核酸特异性结合，并在一定波长和剂量的光照作用下高效率地灭活试验病毒，而这种复合物与血液中白细胞核酸的结合是非特异性的（另文报道），在有效灭活病毒的条件下（0.1nmol/ml TFO-P,UVA照射剂量为1.00-1.62J/cm^2)，光化学效应对被处理血液的凝血功能、红细胞膜ATP酶活性无显著影响，反而有使血液红细胞携氧能力改善，粘附性降低，膜弹性增加的现象^[4]。这种结果使我们对TFO－P及其光化学效应的深入研究及应用产生了极大兴趣，于是继续观察了其对血液白细胞的影响，以了解被处理血细胞悬液发生的较全面的生物效应，为进一步的应用研究打下基础。