β-琼胶酶AgaB催化活性的定向进化

用体外定向进化技术提高了β-琼胶酶AgaB热稳定突变酶M446的催化活性。采用易错PCR和化学诱变法相结合的方法,构建了M446的突变体文库;利用琼胶酶降解琼胶在平板上产生水解圈的特性,建立了阳性克隆的高通量筛选体系。最终筛选得到酶活性得到提高且保持较高耐热性的突变酶M117,其酶活提高为突变酶M446的3倍。测序分析发现编码突变酶M117的DNA序列中有4处点突变,其中2处为同义突变,另外2处引发氨基酸替换,分别为R9K和1111V。对突变酶M117与M446的动力学常数进行了比较,发现M117的Km值降低了93.4％,Kcat／Km值提高了15倍,由此可以推断突变酶M117比活力提高的主要原因是酶与底物的亲和能力提高。     

低温培养对大肠杆菌电穿孔转化效率的影响

在18℃和37℃振荡培养大肠杆菌DH5α并制备感受态细胞,用Eppendorf公司的Multiporator电转移仪进行电穿孔转化,研究了培养温度对转化效率的影响。实验结果表明,低温(18℃)培养的细菌,回收时的OD600值在0.5～1.0时,转化效率都维持在高水平;而在37℃培养的细菌,转化效率仅在OD600 0.6～0.7时出现一个锐利的峰值,此OD600值前后转化效率显著下降。在不影响细胞生长的情况下,18℃培养细菌的转化效率随电场强度增加而升高;而37℃培养的细菌在电场强度超过20.5 kV/cm时转化效率将大幅度下降。另外,还对影响转化效率的其他因素(培养基、振荡培养时的转速、细胞密度、质粒浓度、电击前后冰浴时间等)进行了优化,建立了一个便利而高效的质粒DNA电转化方法,获得1.02×10~10cfu/μg DNA的高转化效率。     

基于良好表达框架的全合成人源抗体库的构建方法

构建大容量高质量抗体库,从而提高针对任意抗原的重组抗体的筛出率是一项有意义而又繁琐的工作。本文在现有建库方法的基础上,兼顾操作方法的简便和高质量抗体库的要求,设计了一种易于操作、步骤简洁的建库方法,并通过构建一个中等库容的单骨架全合成单链抗体模式库,验证了该方法的可行性。本工作选用两条表达性能良好,在入抗体库中高频率出现的胚系基因作为抗体库的骨架,以期保证合成库的代表性和良好的表达折叠性能。在可变区的设计上,对重轻链可变区的CDR3区同时进行了随机化。在CDR区随机化合成策略的选择上,采用一种新颖的分组式合成法。本工作为其他骨架或多骨架合成库的构建提供了一种可供参考的构建模式,本抗体库也可用于抗体前导物的筛斌。     

海洋细菌Renibacterium sp.QD1产壳聚糖酶发酵培养基的统计优化

目的:通过对发酵培养基的统计优化提高海洋细菌Renibacterium sp.QD1壳聚糖酶的产量。方法:通过Plackett-Burman实验筛选影响壳聚糖酶产量的显著性因素。在此基础上利用最陡爬坡路径逼近最大响应区域,利用响应面法进行回归分析。结果:确定了影响壳聚糖酶产量的3个显著因素,其最佳浓度分别是壳聚糖14.23g/L、酵母粉4.72g/L、p H6.42。经模型验证,预测值与验证实验平均值接近。结论:在最优培养基中壳聚糖酶活力达到608.11U/m L,比优化前提高了52.03%。     

RAPD和STS分子标记技术鉴定酒花品种和纯度

运用 DNA 片断的多态性分析判定酒花品种指纹,以5个随机引物成功鉴定了11个常用酒花品种,包括4个香花,5个苦花,青岛大花和 Cluster。Kirin一段多态的随机扩增多态性 DNA(RAPD)片段被转化成序列标记位点(STS),STS 扩增可以检测到青岛大花中5%的麒麟丰禄混合率。     

利用DNA重组技术构建产生多聚甘露糖醛酸的突变菌株

本文旨在以海洋细菌Pseudomonas sp.QDA褐藻多糖(alginate)生物合成操纵元中的algG基因为靶点,利用DNA重组技术改建褐藻多糖的生物合成途径,以期获得产生甘露糖醛酸的突变菌株.首先,利用PCR克隆algG基因两侧大小分别为1.7kb和1.8kb的DNA片段作为同源片段,用编码Gm抗性的aacC1基因替换algG基因,构建成打靶载体pEX100TUDG.将打靶载体转入QDA,利用Gm抗生素和蔗糖为选择压力进行培养,通过PCR和Southern杂交验证,获得了突变菌株.1H-NMR、PAGE和GPC分析发现,突变菌株胞外产物为多聚甘露糖醛酸.该突变菌株的获得丰富了具有较高药物开发价值的甘露糖醛酸的来源,为褐藻多糖途径工程的进一步研究提供了理论依据和技术支持.