外源脂肪酶在毕氏酵母表面展示及发酵过程分析

分别考察基于絮凝素和凝集素2种不同展示系统,展示有外源脂肪酶CALB(Candidan Antarctica lipase B)的重组展示酵母的展示酶活、上清酶活,发现毕赤酵母作为宿主在外源脂肪酶展示过程会分泌目的蛋白至上清中,引起"外泄",进一步通过重组展示酵母外源蛋白鉴定、外源蛋白去糖基化、发酵过程中蛋白变化趋势观察,表明基于絮凝素系统的非共价锚定是引起展示过程中蛋白外泄比例过高的主要原因,研究为实现脂肪酶在毕赤酵母细胞的高效展示进而提高展示酶的催化效率提供了理论指导。     

酵母耐性评价方法的比较

酿造酵母对发酵中所形成胁迫的耐受能力是乙醇工业生产中酵母菌株所应具备的重要特性。为了筛选和评价具有胁迫耐受能力的乙醇发酵生产酵母菌株,需要建立通用的实验方法。文中通过比较耐性生长曲线、点滴试验和杜氏管产气3种方法,来评价4株酿造酵母的耐渗性能、耐乙醇性能及耐温性能。结果表明,评价体系下4株酵母耐渗性与耐温性体现了相似的趋势;在耐乙醇性能评价试验中,点滴试验评价与耐性生长曲线评价结果拟合度较高,而杜氏管产气作为酵母耐性评价的方法实验中未能得到很好的规律,其可靠性有待商榷。     

黑曲霉表面展示南极假丝酵母脂肪酶B催化仲醇动力学拆分

光学活性仲醇是合成多种生物活性化合物的原料和关键中间体,微生物细胞表面展示酶在生物催化和生物转化制备生化产品等方面表现出良好的应用性。研究了黑曲霉表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)制备的全细胞催化剂(AN-CALB)动力学拆分仲醇的催化性能。以2-辛醇作为反应底物,研究了酰基供体、2-辛醇与乙酸异丙烯酯物质的量比、AN-CALB添加量、水活度、温度及溶剂对AN-CALB催化2-辛醇拆分的影响,确定最优反应条件为:以乙酸异丙烯酯为酰基供体、2-辛醇与乙酸异丙烯酯物质的量比1∶1、AN-CALB添加量50 g·L-1、水活度0.11、温度45℃、以甲苯为溶剂,在此条件下,反应12 h的底物转化率达47.4%,eep值为99.6%,E值大于600。在最优反应条件下,AN-CALB对8种仲醇均表现出较好的拆分效果,底物转化率最高接近50%。该研究为仲醇动力学拆分提供了新的催化剂选择。     

重组脂肪酶全细胞催化单糖酯的合成

利用毕赤酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipaseB,CALB)为全细胞催化剂,以不同单糖(葡萄糖、果糖和甘露糖)为酰基受体,不同脂肪酸(月桂酸、油酸和棕榈酸)为酰基供体,在以不同有机溶剂为介质的非水相体系中催化合成糖酯.探讨全细胞脂肪酶CALB合成糖酯的反应条件,结果表明:毕赤酵母表面展示CALB全细胞催化剂在叔戊醇/二甲基亚砜(4:1,v/v)介质中可以有效的合成糖酯,研究中各种酰基受体和酰基供体在全细胞脂肪酶催化下均能合成糖酯,其中果糖作为酰基受体产物浓度最高.     

常压室温等离子体诱变与微生物液滴培养系统联用筛选L-组氨酸产生菌

利用常压室温等离子体（ARTP）诱变技术,对野生型谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC 14067诱变处理。通过全自动高通量微生物液滴培养系统（MMC）和平板选育组氨酸结构类似物的抗性突变株。使用48孔板发酵初筛及摇瓶发酵复筛,最终从耐受3-氨基-1,2,4-三氮唑10 g/L和D-组氨酸8 g/L的抗性突变株中筛选得到菌株Cg-F4,其L-组氨酸产量为（0.561±0.016）g/L,并且经过7次连续传代实验验证了该菌株稳定性良好。     

酶法催化生产1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯

1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(OPO)是母乳脂肪中甘油三酯的重要组成成分,可有效改善和保证棕榈酸在婴幼儿体内的吸收和利用。本文对其脂肪酶催化生产进行了简单探索,以三棕榈酸甘油酯(PPP)和油酸(OA)为底物,通过1,3-特异性脂肪酶RMIM催化的酸解反应成功制备了1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯。经单因素优化后最佳反应条件为:PPP与油酸摩尔比1:6,加酶量8%,反应温度50℃,反应时间6 h,反应产物中脂肪酸组成为:油酸54.86%,sn-2位棕榈酸含量为87.64%。     

谷氨酸棒杆菌S9114在不同溶氧条件下发酵生产谷氨酸的代谢流分析

建立了谷氨酸棒杆菌S9114合成L-谷氨酸(L-Glu)的代谢流平衡模型,应用该模型并结合S9114在10%和30%溶氧条件下发酵至中后期时胞外相关产物的分泌情况计算出其代谢流分布;通过MATLAB线性规划得到了谷氨酸合成的理想代谢流分布。代谢流分析结果表明,减少HMP和TCA循环的代谢流量,增加CO2固定的代谢流将有利于谷氨酸的合成;在谷氨酸发酵工艺控制中,溶氧是关键因素,发酵中后期提高溶氧有利于谷氨酸的生成,同时可抑制副产氨基酸的产生;主要副产物乳酸在理想代谢流分布中仍占有一定比例,说明乳酸在整个代谢过程中起到一定的作用。     

序列结构对酪氨酸酚裂解酶耐热性的贡献

为了解酪氨酸酚裂解酶（TPL）热稳定性与序列之间的关系,为突变产生耐热性的酪氨酸酚裂解酶提供参考,利用生物信息学对来源于Symbiobacterium toebii的耐热酪氨酸酚裂解酶StTPL、来源于Fusobacterium nucleatum的耐热酪氨酸酚裂解酶FnTPL和来源于Citrobacter freundii的中温酪氨酸酚裂解酶CfTPL进行进化树、一级结构、二级结构和三级结构的比较。随着TPL中一级结构中脯氨酸含量增多,最适反应温度的增加,StTPL、FnTPL和CfTPL的脯氨酸含量分别为5.02%、3.70%、2.85%,二级结构中β-折叠和转角较多,分别为25.51%、25.00%、23.91%,这些特征符合文献报道的耐热酶和中温酶的区别。将StTPL、FnTPL和CfTPL的三维结构叠加比对发现,310-313残基区域、残基13、82-88残基区域叠加效果差,313残基突变有利于CfTPL提高热稳定性,StTPL中的Ala13、Glu83、Thr407突变有利于StTPL热稳定性,推测以上残基区域和热稳定性相关,也符合已有文献报道的情况。此外,有关生物信息学分析为进一步理解超稳酶的超稳机制以及筛选改造新的超稳酶提供了初步参考。     

抗辐射不动杆菌碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达

本研究将来自抗辐射不动杆菌CMC-1的碱性脂肪酶基因去掉信号肽,经密码子优化及全基因合成后克隆到pPICZαA载体,构建了重组质粒pPICZαA-ARL,质粒线性化后转化毕赤酵母X33,筛选得到分泌表达碱性脂肪酶的重组毕赤酵母X33/pPICZαA-ARL。摇瓶发酵液上清酶活最高达65 U/mL,初步研究了该脂肪酶的酶学性质,其最适作用温度为50℃,最适pH为9.0,最适底物是对硝基苯酚辛酸酯。     

HPLC法测定谷氨酸发酵中有机酸含量的方法研究

建立了谷氨酸发酵中有机酸含量的高效液相色谱分析方法.最优色谱条件为色谱柱为安捷伦XDB-C8,检测波长215nm,流动相为甲醇:0.01mol/LKH2PO4(pH2.5)=5:95,流速ImL/min.成功分离了样品中的谷氨酸、内酮酸、α-酮戊二酸、乳酸、柠檬睃和琥珀酸.此法准确、快捷、重复性好,适合谷氨酸发酵中有机酸的含量测定.